載脂蛋白E基因多態(tài)性與老年人輕度認(rèn)知功能障礙的關(guān)聯(lián)研究

何　璐，袁也豐，任稱(chēng)發(fā)，孫偉銘，鄒　卿

載脂蛋白E基因多態(tài)性與老年人輕度認(rèn)知功能障礙的關(guān)聯(lián)研究

何璐，袁也豐，任稱(chēng)發(fā)，孫偉銘，鄒卿

摘要目的研究江西省老年人載脂蛋白E基因（ApoE）多態(tài)性的分布及其與輕度認(rèn)知功能障礙（MCI）的關(guān)系。方法以符合美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4版（DSM-IV）診斷標(biāo)準(zhǔn)的120例MCI老人作為患者組，以120例健康體檢者作為對(duì)照組，使用聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行ApoE基因多態(tài)性的檢測(cè)。結(jié)果兩組人群中ApoEε3／3基因型分布的百分比最大，其次為ApoEε3／4，而ApoEε2／2最少；患者組和對(duì)照組ApoEε4基因頻率分別為14．17%、7．91%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2＝4．77，P＜0．05），兩組人群中ApoEε3等位基因分布的百分比最大；ApoEε4等位基因與MCI呈正相關(guān)性（OR＝1．92，P＝0．029）。結(jié)論江西省漢族老人中，

ApoEε3／3為最常見(jiàn)的基因型，ApoEε3為最常見(jiàn)的等位基因，ApoEε4等位基因可能是老年人MCI發(fā)病的危險(xiǎn)因子。

關(guān)鍵詞老年人；輕度認(rèn)知功能障礙；載脂蛋白E基因多態(tài)性

1　材料與方法

1．1病例資料

1．1．1患者組

選取2014年2月～9月于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心身醫(yī)學(xué)科門(mén)診就診的MCI患者120例作為患者組，其中男73例，女47例；年齡60 ～88（68．31±6．06）歲，病期3月～10年。入組標(biāo)準(zhǔn)：符合美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4版（DSM-IV）中的MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)：①主觀感覺(jué)記憶力減退；②全面衰退量表、簡(jiǎn)明精神狀態(tài)檢查量表及日常生活能力量表檢測(cè)存在認(rèn)知功能減退，但不足以診斷癡呆；③生活與社會(huì)功能降低；④缺血指數(shù)量表（Hachinski）評(píng)分≤4分，排除由特定原因引起的認(rèn)知功能損害；⑤病程至少大于3個(gè)月。年齡≥60歲；漢族；相互間無(wú)血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷不明；②嚴(yán)重軀體疾病；③阿爾茨海默病、帕金森氏病、腦器質(zhì)性疾病等所致的各種癡呆患者；④外地遷移至江西暫時(shí)居住的患者。

1．1．2對(duì)照組

選取同期南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院門(mén)診健康體檢者120例作為對(duì)照組，其中男76例，女44例；年齡61～84（67．31±5．94）歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：①不符合DSM-IV中MCI的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②性別、年齡、文化程度、生活背景等與患者組盡量匹配，并確定無(wú)血緣關(guān)系；③無(wú)癡呆家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)同患者組。患者組和對(duì)照組在性別、年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2＝0．374，F(xiàn)＝1．334，P＞0．05）。

1．2方法

1．2．1DNA提取

常規(guī)抽取研究對(duì)象外周靜脈血2 m l，EDTA-Na2抗凝，采用北京康為世紀(jì)公司提供的BloodGen Mini Kit（0．1～1 ml）試劑盒提取DNA。1%瓊脂糖凝膠、電壓150 V、電流100 mA、20 min電泳后凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1．2．2ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)

對(duì)所提取的全基因組DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增，應(yīng)用軟件Primer Premier5對(duì)ApoE基因的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)及合成，引物序列上游引物：5’-AGGAACAACTGACCCCGGT-3’，下游引物：5’-TGCTCCTTCACCTCGTCCA-3’。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體系50μl：Prem Taq（Ex Tag Version）2．0 D331A 12．5μl，基因組 DNA 0．3μg，上下游引物（10μmol／L）各1μl，加滅菌蒸餾水定容至50μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火35 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸6 min后降至4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收

2015－04－08接收

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行分析，先計(jì)算出各等位基因頻率和基因型頻率，做Hardy-Weinberg吻合度檢驗(yàn)；按公式優(yōu)勢(shì)比（odds radio，OR）＝（a／c）／（b／d）＝ad／bc進(jìn)行OR分析，采用X2檢驗(yàn)進(jìn)行組間等位基因頻率比較，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

基因組DNA部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2ApoE基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

ApoE基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為469 bp，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3Hardy-Weinberg吻合度檢驗(yàn)

患者組和對(duì)照組ApoE基因型頻率及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，吻合度檢驗(yàn)良好（X2＝4．76、2．33，P＞0．05）。

2.4ApoE基因型分布

患者組和對(duì)照組ApoE基因型頻率均以ε3／3最高，其次為ε3／4，對(duì)照組缺失ε4／4，兩組間ApoE基因型比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1　患者組與對(duì)照組　ApoE基因型頻率的分布［n（%）］

2.5ApoE等位基因頻率

患者組和對(duì)照組ε4等位基因頻率分別為14．17%、7．91%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2＝4．77，P＝0．029），兩組ApoE等位基因頻率均以ε3最高，見(jiàn)表2。

表2　患者組與對(duì)照組　ApoE等位基因頻率的分布（%）

2.6ApoE等位基因頻率風(fēng)險(xiǎn)分析

通過(guò)計(jì)算OR值估計(jì)ApoE基因與MCI的關(guān)系，結(jié)果證明ApoEε4等位基因與MCI呈正相關(guān)性（OR＝1．920，95%CI：1．061～3．472），ε2（OR＝0．661，95%CI：0．334～1．307）、ε3（OR＝0．803，95%CI：0．507～1．272）等位基因與MCI發(fā)病無(wú)顯著相關(guān)性。

3　討論

MCI是介于正常老化與癡呆之間的一種臨界狀態(tài)，屬于退行性疾病，平均每年約10%～15%的MCI患者發(fā)展為癡呆［2-3］。近年來(lái)關(guān)于MCI的生物學(xué)診斷標(biāo)志取得了較大的進(jìn)展。研究［4］表明ApoE基因?qū)CI的發(fā)病具有一定的影響。

ApoE基因位于19號(hào)染色體，在編碼112和158位氨基酸的突變產(chǎn)生3種等位基因，即ε2、ε3、ε4。流行病學(xué)研究［5］顯示，中國(guó)漢族人群中ApoE基因最常見(jiàn)的基因型為ε3／3，最常見(jiàn)的等位基因?yàn)棣?。本研究測(cè)定的6種基因型中，ε3／3基因型分布頻率最高，ApoE等位基因中以ε3分布頻率最高，與上述流行病學(xué)研究結(jié)果相符。

本研究顯示對(duì)照組ε4等位基因頻率為7．91%，與國(guó)內(nèi)報(bào)道［6］的我國(guó)漢族人群的7．5%基本一致，患者組ε4等位基因頻率則高達(dá)14．17%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與國(guó)內(nèi)外一些相關(guān)研究［7-8］的結(jié)果基本一致，提示MCI可能與ApoEε4等位基因相關(guān)。

研究［9］表明，ApoEε4等位基因是MCI的危險(xiǎn)因素。Barabash etal［10］分析ApoE基因型對(duì)MCI的影響，結(jié)果顯示，ApoEε4等位基因可增加MCI的危險(xiǎn)度（OR＝6．04）。本研究通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)分析提示ApoEε4等位基因與MCI呈正相關(guān)性（OR＝1．92），攜帶ApoEε4等位基因者患MCI的可能性是未攜帶者的1．92倍，推測(cè)ApoEε4等位基因可能是MCI患病的風(fēng)險(xiǎn)因子之一。兩項(xiàng)研究OR值差異較大，可能與研究對(duì)象的入組標(biāo)準(zhǔn)、種族、地域等因素有關(guān)，也可能與研究對(duì)象的年齡范圍有關(guān)，本研究以國(guó)內(nèi)普遍認(rèn)可的60歲作為老年人的界定，與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)存在偏差。

陳靜等［11］對(duì)貴州市≥60歲的MCI老年人進(jìn)行ApoE多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果提示ApoEε2為MCI的保護(hù)因子。但本研究結(jié)果提示ε2等位基因與MCI無(wú)顯著相關(guān)性，這可能與研究對(duì)象數(shù)量、地域、入組標(biāo)準(zhǔn)及研究試驗(yàn)方法不同等因素有關(guān)，也可能是環(huán)境或其他因素參與遺傳交互作用的結(jié)果。

綜上所述，本研究證實(shí)了江西地區(qū)漢族老年人MCI與ApoE基因的多態(tài)性存在關(guān)聯(lián)，ApoEε4等位基因可能是MCI的風(fēng)險(xiǎn)基因，這提示ApoE基因型檢測(cè)可作為臨床醫(yī)師評(píng)估MCI發(fā)病危險(xiǎn)性的輔助手段。但由于MCI的患病受多重因素影響，下一步擬對(duì)江西地區(qū)MCI患者進(jìn)行大樣本研究，進(jìn)一步探討ApoE基因多態(tài)性與MCI的關(guān)系，為MCI的防治提供依據(jù)。

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中圖分類(lèi)號(hào)R 749．99

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）10－1468－03輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變，是一種神經(jīng)功能障礙，多見(jiàn)于老年人，臨床特點(diǎn)為記憶力下降、注意力減退、工作能力和效率降低、新事物學(xué)習(xí)能力下降，但日常認(rèn)知能力和生活自理能力相對(duì)保持，故被大多數(shù)學(xué)者稱(chēng)為“癡呆的前期狀態(tài)”［1］，其病因未明，因此探討MCI病因、發(fā)病機(jī)制及防治措施已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。該研究選取載脂蛋白E基因（Apo lipoprotein E gene，ApoE）為目標(biāo)基因，對(duì)遺傳背景相似的江西地區(qū)漢族正常老人及MCI患者進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討ApoE基因與MCI的關(guān)系，旨在為MCI的防治提供依據(jù)。

基金項(xiàng)目：江西省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20132BBG70069）；江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2009BAI77B03）

作者單位：南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心身醫(yī)學(xué)科，南昌330006

作者簡(jiǎn)介：何璐，女，碩士研究生；袁也豐，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yuanyefen＠sina．com試劑盒（SK1141，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）純化后，運(yùn)用3730序列分析儀對(duì)目的基因進(jìn)行直接測(cè)序，從而獲得ApoE基因的不同基因型。

The study on the relation between the distribution of Apo lipoprotein E（ApoE）genotypes and m ild cognitive impairment

He Lu，Yuan Yefeng，Ren Chengfa，et al
（The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang330006）

AbstractObjectiveTo study the relation between the distribution of Apo lipoprotein E（ApoE）genotypes and mild cognitive impairment in Jiangxi，China．MethodsThe patientgroup was collected from patientswith MCI（n ＝120）in accordancewith the diagnostic and statisticalmanual ofmental disorders fourth edition（DSM-IV）diagnosis standard．The normal group was collected from the healthy check-ups．The ApoE gene polymorphism were determined using the polymerase chain reaction．Resu ltsThe ApoE ofε3／3 genotypes had highest frequency，followed byε3／4 andε2／2 had lowest frequency in the elderly of Jiangxi．The frequency of the ApoEε4 genotypeswas higher in MCIgroup than in the control group（14．17%vs7．91%，P＜0．05）．ApoE epsilon 4 allele was positively associated with the onset of MCI（P＜0．05）．ConclusionAmong the elderly of Jiangxi，ApoEε3／3 is the most common genotype，ApoEε3 is themost common allele，MCIprevalence is associated with ApoE gene polymorphism and the ApoEε4 allele could be a pathogenic risk factor for MCI．

Key wordselderly；mild cognitive impairment；Apo lipoprotein E gene polymorphism