吲哚胺2，3－二氧酶（IDO）與CINⅢ及宮頸癌T淋巴細胞的相關性研究

杜世華，胡傳玉，魯大偉，李　燕，?！×?/p>

吲哚胺2，3－二氧酶（IDO）與CINⅢ及宮頸癌T淋巴細胞的相關性研究

杜世華，胡傳玉，魯大偉，李燕，桑琳

摘要目的研究吲哚胺2，3-二氧酶（IDO）表達對子宮頸癌患者T淋巴細胞活性的影響，進一步了解子宮頸癌的免疫逃逸機制。方法選擇子宮頸上皮內瘤變Ⅲ級（CINⅢ）組織20例（CINⅢ組），子宮頸癌患者組織20例（宮頸癌組），正常宮頸組織20例（正常組），采用流式細胞儀檢測各組外周血中CD3＋T細胞、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs數量、CD4＋T細胞／CD8＋T細胞。采用Western blot法和半定量RT-PCR法檢測各組子宮頸組織IDOmRNA及其蛋白表達，分析各組子宮頸組織中IDO的表達對宿主T淋巴細胞活性的影響。結果正常組、CINⅢ組及宮頸癌組3組之間IDO蛋白表達強度差異有統計學意義（P＜0．001）。宮頸癌組IDO表達高于CINⅢ和正常組（P＜0．001），CINⅢ組高于正常組（P＜0．001）。宮頸癌組外周血中CD3＋T細胞、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs數量與正常組和CINⅢ組差異有統計學意義（P ＜0．001）。3組中IDO蛋白表達與外周血中CD3＋T細胞、CD4＋T細胞／CD8＋T細胞呈負相關性，與CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs呈正相關性。結論IDO抑制外周血T淋巴細胞對腫瘤的殺傷效應，使子宮頸癌患者免疫功能低下，有利于腫瘤細胞免疫逃逸，從而使病情進展。

關鍵詞吲哚胺2，3-二氧酶；子宮頸癌；CINⅢ；T淋巴細胞

子宮頸癌在全球婦女的癌癥死因中高居第2位，世界上每年新發病例大約為40多萬例，死亡率約為50%［1］。子宮頸癌細胞通過調節宿主機體相關免疫反應引起免疫耐受，在機體對子宮頸癌的免疫監控中，細胞毒性T淋巴細胞發揮了十分重要的作用［2］。腫瘤細胞可以逃避免疫系統的清除，在腫瘤微環境修飾和自身免疫編輯的作用下，成為可以存活的休眠期腫瘤細胞，在惡性腫瘤的發生、發展過程中，免疫逃逸發揮了重要的作用［3］。研究［4］表明，吲哚胺 2，3-二氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）相對分子量為42 000，由403個氨基酸組

成，是一種催化色氨酸吲哚環氧化裂解的限速酶，IDO能在許多腫瘤的腫瘤浸潤組織、間質中表達，在腫瘤的發生、發展以及轉移過程中起到非常重要的作用。最近對IDO的研究［5］中，顯示其對T細胞的誘導增殖作用，引起了廣泛的關注，暗示IDO可能在腫瘤的侵襲和轉移中發揮了重要的作用。目前國內外對IDO在子宮頸癌患者機體免疫系統中的影響的具體機制研究較少，該課題研究IDO在CINⅢ及宮頸癌組織中的表達，探討其對T淋巴細胞活性的調控及在子宮頸癌發生、發展中的機制，以期為子宮頸癌預防和治療尋求新途徑。

1　材料與方法

1．1病例資料

隨機選擇2012年2月～2015年1月因子宮平滑肌瘤在安徽醫科大學附屬合肥醫院婦產科手術患者的正常子宮頸組織20例，年齡41～62歲，中位年齡49．5歲；同期在我科手術的子宮頸癌患者20例，年齡41～68歲，中位年齡49歲。同期CINⅢ患者20例，年齡40～72歲，中位年齡49歲。各組之間年齡差異無統計學意義（P＞0．05）。

1．2主要儀器及試劑

FACSCalibur流式細胞儀（美國Becton Dikinson公司）；Biorad MJMini梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司）；小鼠抗人IDO抗體、鼠抗人CD4FITC CD8PE／CD3PE-Cy5、CD4＋CD25＋Foxp3＋T細胞檢測試劑盒（美國Biolegend公司）；IDO上、下游引物及GAPDH上、下游引物由上海捷瑞生物工程公司合成。

1．3取材方法

對納入標準的宮頸癌及CINⅢ患者于陰道鏡下取病變組織，約100～140 mg，子宮肌瘤患者于子宮切除術后取宮頸組織，約100～140 mg，并置于液氮罐中冷凍保存。

1．4實驗方法

對符合標準的患者于取標本的第2天抽取空腹靜脈血約1m l置于抗凝管中通過流式細胞儀檢測各組外周靜脈血中CD3＋T細胞、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs的數量及CD4＋T細胞／CD8＋T細胞，步驟按說明書。采用半定量RT-PCR法檢測各組子宮頸組織中IDO mRNA及其蛋白含量的表達：將RNA濃度調至相同

2015－06－25接收

1．5統計學處理

2　結果

2.1各組半定量RT-PCR檢測結果

正常組、CINⅢ組、宮頸癌組3組半定量RT-PCR檢測IDOmRNA值分別為0．724±0．070 4、0．321 1±0．224 2、0．621 8±0．142 1。采用Tamhane法進行組間比較顯示宮頸癌組表達高于CINⅢ組和正常組（P＜0．001），CINⅢ組則高于正常組（P＜0．001），差異均有統計學意義。

表1　外周靜脈血　CD3＋T細胞、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞及　CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs數量的變化（±s）

表1　外周靜脈血　CD3＋T細胞、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞及　CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs數量的變化（±s）

與宮頸癌組比較：*P＜0．05，**P＜0．01，***P＜0．001

組別　　例數　CD3＋T細胞　CD8＋T細胞　CD4＋T細胞　CD4＋T細胞／CD8＋T細胞Tregs正?！?0　68．83±7．44***　27．69±3．93***　37．48±4．73**　1．39±0．21***　6．06±1．45 CD4＋CD25＋Foxp3＋*** CINⅢ　20　66．74±5．26***　21．78±3．14***　37．40±3．83*　1．38±0．01***　7．02±1．22***宮頸癌　20　50．68±6．18　24．64±3．23　22．84±5．96　0．96±0．37　9．89±2．47

2.2W estern b lot法檢測IDO蛋白表達

本實驗結果顯示，正常組中65% （13／20）出現了目的條帶的顯示，35%（7／20）未見明顯目的條帶的顯示，僅有2例（2／20，10%）IDO相對積分光密度值＞0．1。CINⅢ組織中相對積分光密度值＞0．1的有15例（15／20，75%），相對積分光密度值＜0．1的有4例（4／20，20%），1例（1／20，5%）未見目的條帶。宮頸癌組在45 ku處均可見目的條帶的顯示（20／20，100%），相對光密度值＞0．1。對未出現目的條帶顯示的子宮頸組織相對積分光密度值標記為0。分析顯示正常組、CINⅢ組和宮頸癌組中IDO蛋白的表達量均不同，3組IDO表達相對積分光密度值分別為0．048 5±0．034 7、0．290 5±0．264 1、0．511 5 ±0．153 8，差異均有統計學意義（F＝45．548，P＜0．001）。采用Tamhane法進行比較顯示宮頸癌組IDO蛋白表達明顯高于CINⅢ組和正常組（P＜0．001），而CINⅢ組明顯高于正常組（P＜0．001），差異均有統計學意義。

2.3IDO表達與外周靜脈血CD3＋T細胞、CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs數量及CD4＋T細胞／CD8＋T細胞的相關性

流式細胞儀檢測顯示外周靜脈血T細胞亞群數量變化見表1。宮頸癌組外周靜脈血中CD3＋T細胞、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞數量均低于正常組（P＜0．001，P＜0．001，P＜0．01）和 CINⅢ組（P＜0．001，P＜0．001，P＜0．05），正常組和CINⅢ組差異無統計學意義（P＝0．288、0．658、0．524），宮頸癌組外周靜脈血中CD4＋T細胞／CD8＋T細胞顯著低于正常組和CINⅢ組（P＜0．001），正常組和CINⅢ組差異無統計學意義（P＝0．964）。宮頸癌組CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs的數量顯著高于CINⅢ組和正常組（P＜0．001）。CINⅢ組和正常組差異無統計學意義（P＝0．086）。

2．4相關性分析

采用Bivariate相關性分析結果顯示，正常組 IDO mRNA表達及其蛋白表達與CD4＋T細胞／CD8＋T細胞（r＝－0．644、－0．686，P ＜0．05）、CD3＋T細胞（r＝－0．547、－0．455，P＜0．05）呈負相關性；與CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs（r＝0．477、0．514，P＜0．05）呈正相關性。CINⅢ組IDO mRNA表達及其蛋白表達與CD 3＋T細胞（r＝－0．785、－0．768，P＜0．001），CD4＋T細胞／CD8＋T細胞（r＝－0．778、－0．771，P＜0．001）呈負相關性；與 CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs（r＝0．843、0．850，P＜0．001）呈正相關性。宮頸癌組IDO mRNA及其蛋白表達與CD3＋T細胞（r＝－0．882、－0．919，P＜0．001），CD4＋T細胞／CD8＋T細胞（r＝－0．871、－0．733，P＜0．001）呈負相關性；與CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs（r＝0．886、0．824，P＜0．001）呈正相關性。

3　討論

研究［6］顯示，宿主免疫功能受到抑制的婦女是正常婦女患子宮頸癌大約4～5倍。細胞毒T淋細胞能有效識別和殺傷腫瘤細胞［7］。目前研究［8］表明，宿主外周T細胞亞群的數量與腫瘤的發生、發展、預后有著密切的相關性。IDO的高表達是導致宿主對腫瘤細胞產生免疫逃逸的重要因素之一［9］。本研究采用流式細胞儀檢測正常子宮頸組織，CINⅢ和子宮頸癌3組患者外周靜脈血中T淋巴細胞亞群的數量，采用Western blot法和半定量RT-PCR法檢測上述3組子宮頸組織中IDOmRNA及其蛋白的表達量，分析各組子宮頸組織中IDO的表達對宿主外周靜脈血T淋巴細胞的影響，初步探討IDO在子宮頸癌的發生發展中的作用，同時了解IDO對機體免疫系統的影響。

研究［10］顯示宮頸腫瘤組織中的IDO的表達量均顯著高于鄰近正常的組織。本研究結果顯示宮頸癌組IDO mRNA表達高于CINⅢ和正常組，而CINⅢ組高于正常組。這提示隨著腫瘤的發生、發展，IDO引起的宮頸癌免疫抑制功能逐步增加。

陳婉玲等［11］發現T淋巴細是宿主抗腫瘤免疫的比較重要的部分，研究顯示，T淋巴細胞與宮頸癌的發展、預后有著較為密切的關系，正常時候T淋巴細胞及其亞群功能及數量相對穩定，假如發生機體免疫抑制，則較易發生腫瘤的免疫逃逸從而引起腫瘤的發生、發展，機體預后則較差。本研究結果表明：宮頸癌患者外周靜脈血中上述T細胞數量均顯著低于CINⅢ組和正常組，CINⅢ組和正常組卻差異無統計學意義，宮頸癌組外周靜脈血中CD4＋T細胞／CD8＋T細胞顯著低于正常組和CINⅢ組。宮頸癌組CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs的數量顯著高于正常組，這可能提示宮頸癌患者機體的免疫功能得到抑制。

Mumn etal［8］研究發現，IDO可以抑制機體T淋巴細胞及其亞群的發生、發展，從而可以促進T淋巴細胞及其亞群發生細胞凋亡。本實驗中正常組IDOmRNA表達及蛋白表達與CD3＋T細胞、CD4＋T細胞／CD8＋T細胞呈負相關性；與 CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs呈正相關性。CINⅢ組IDO mRNA表達及其蛋白表達與T淋巴細胞亞群數量呈負相關性，與CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs呈正相關性。宮頸癌組IDOmRNA及其蛋白表達與T淋巴細胞亞群數量呈負相關性，與CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs呈正相關性。結果提示宮頸癌患者機體中IDO的高表達可能是影響T細胞及其亞群數量及功能的重要原因。

參考文獻

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中圖分類號R 737．33

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1497－04

作者單位：安徽醫科大學附屬合肥醫院婦產科，合肥230011

作者簡介：杜世華，女，副主任醫師，責任作者，E-mail：13855195735＠163．com濃度，RT-PCR檢測各宮頸組織中的IDO。IDO上游引物：5′-TTCAGTGCTTT-GACGTCCTG-3′，下游引物：5′-CCTTTGGCTTCAGTTTTGA-3′，擴增片段305 bp；GAPDH上游引物：5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′，下游引物：5′-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′，擴增片段134 bp。Western blot法檢測各宮頸組織中IDO表達：取20～70 mg組織加400μl去污劑裂解液，裂解30 min，取上清液，蛋白定量后取20μg總蛋白分離，電轉移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上，室溫下用5%牛血清蛋白封閉，分別與小鼠抗人IDO抗體、抗GAPDH抗體雜交過夜，用過氧化物酶標記羊抗鼠IgG孵育。

Correlation study between indoleam ine 2，3-dioxygenase（IDO）and T lymphocytes in cervical cancer and CINⅢ

Du Shihua，Hu Chuanyu，Lu Dawei，et al
（Dept of Obstetrics and Gynecology，The Affiliated Hefei Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230011）

AbstractObjectiveTo investigate the expression of indoleamine2，3-dioxygenase（IDO）how to effect on T lymphocyte activity，in order to understand the mechanism of immune escape of cervical cancer．MethodsSelected 20 patientswith CINⅢ，20 caseswith cervical cancer and 20 caseswith normal cervical for comparison，used flow cytometry to detcet the number of each group CD3＋T，CD4＋T，CD8＋T，CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs and CD4＋／CD8＋．Used semi-quantitative RT-PCR and Western blot to detect IDOmRNA and expression of IDO，and to analyze the effection on T lymphocyte active in cervical tissue．ResultsThe expression of IDO was significantly different among the three group（P＜0．001）．The positive rate of IDO in cerival cancerwas significantly higher than that in CINIIIand normal cerival（P＜0．001）．The positive rate of IDO in CINⅢwas significantly higher than that in normal cerival（P＜0．001）．The number of CD3＋T，CD4＋T，CD8＋T and CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs was significantly different among the three group（P＜0．001）．The positive expression of IDO was negatively correlated with the number of CD3＋T，CD4＋T，CD8＋T，and positively correlated with CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs．Conclusion IDO inhibits T lymphocyte activity．Cervical cancer patientswith low immune function can cause the tumor cells escape form immune surveillance，may lead to disease progression．

Key wordsindoleamine 2，3-dioxygenase；cervical cancer；CINⅢ；T lymphocytes