足底電擊誘導(dǎo)樹鼠句條件恐懼記憶模型的建立及抹除

郭呈斌，張　晨，2，王烈成

足底電擊誘導(dǎo)樹鼠句條件恐懼記憶模型的建立及抹除

郭呈斌1，張晨1，2，王烈成1

摘要目的探索足底電擊誘導(dǎo)樹鼩條件恐懼記憶模型的建立及抹除方法。方法測定在無刺激條件下，樹鼩在明暗箱中的活動規(guī)律；然后用梯度刺激實驗測定合適的足底電擊電壓；最后用合適的電壓通過足底電擊誘導(dǎo)并建立實驗組樹鼩條件恐懼記憶模型并抹除其記憶。結(jié)果正常條件下，樹鼩（n＝4）在暗箱中的停留時間明顯多于明箱中的停留時間（P＜0．01）；在兩明箱中，足底電壓梯度刺激實驗顯示，隨著刺激電壓的增加，樹鼩（n＝6）在有刺激的隔間中的停留時間逐漸減少。12 V以后樹鼩在有刺激隔間與無刺激隔間的停留時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義［12 V（P＜0．05）、16 V（P＜0．01）、20 V（P＜0．01）］；實驗組（n＝4）暗箱用16 V刺激電壓足底電擊能夠形成明顯的恐懼記憶（P＜0．001）。在形成明顯的恐懼記憶后，在明箱中給予相應(yīng)的足底電擊4 d，實驗組（n＝4）樹鼩在明箱中停留的時間逐漸減少，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論樹鼩更趨于停留在暗箱中；16 V為較為適合的足底電擊電壓；條件恐懼記憶能夠被誘導(dǎo)并且被新的刺激完全抹除。

關(guān)鍵詞樹鼩；足底電擊；條件恐懼記憶形成和抹除；明暗箱中圖分類號 R 338．2＋7；R 33-33

樹鼩（Tupaia belangeri）是一種小型哺乳動物，屬于哺乳綱，攀鼩目（Scandentia）［1］。主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)［2－3］。樹鼩身體內(nèi)的分子、細胞及解剖結(jié)構(gòu)較貓、犬、鼠等動物更接近于人類［3］。研究［4－5］顯示，在獼猴和樹鼩中均能形成人類阿爾茲海默癥病理樣的老年斑，這在小鼠中是不能形成的。生物信息學(xué)分析［2］顯示，人類與樹鼩在阿爾茲海默病有關(guān)基因具有較高的同源性，這些結(jié)論為人類研究阿爾茲海默病提供了良好的實驗對象。該研究旨在探索樹鼩在足底電擊刺激下形成條件恐懼記憶，以及該恐懼記憶的抹除方法，建立樹鼩條件恐懼記憶動物模型，為進一步研究樹鼩動物模型提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物

雄性成年中緬樹鼩，體重120～180 g。購自昆明實驗動物研究所，飼養(yǎng)室溫度22～25℃，相對濕度55%～75%，12 h光照／12 h黑暗的晝夜循環(huán)。動物在進行此實驗前沒有進行過其他的實驗。實驗操作均在實驗動物操作及福利規(guī)范范圍內(nèi)進行。

1．1．2實驗裝置

實驗裝置見圖1，有2個一樣的隔室。動物逐個進行測試，在每只動物測試結(jié)束后，用75%的酒精進行清洗以消除不同動物之間氣味等相互影響。錄像用的攝像機固定在天花板上。在實驗裝置的底部有數(shù)列銅質(zhì)電極，電極之間間隔1．5 cm，電刺激的電壓由穩(wěn)壓電源（0～30 V）提供。裝置的四面由聚丙烯注塑材料制成，裝置的上面由一層不銹鋼網(wǎng)制成，以防止樹鼩逃跑及方便錄像。每個隔室的內(nèi)徑尺寸為40 cm×40 cm×40 cm，在每個隔室的背面都裝有發(fā)光二極管（light emitting diode，LED），能夠在需要的時候為每個隔室提供照明。整個實驗裝置處于黑暗的環(huán)境中，LED開的隔室稱為明箱，LED關(guān)的隔室稱為暗箱。

1．2實驗方法

1．2．1樹鼩在明暗箱中的活動規(guī)律探索（實驗1）

實驗包含3個階段：訓(xùn)練階段、適應(yīng)階段和實驗階段。在訓(xùn)練階段，所有的動物在無電刺激的情況下每天允許在明暗箱中自由活動30min；在適應(yīng)階段，

2015－03－31接收

1．2．2樹鼩足底電擊不同電壓的測定（實驗2）

該實驗2個隔室皆為明室（即都用LED提供照明）。這個實驗由2個階段組成：適應(yīng)階段和測試階段。適應(yīng)階段的實驗和實驗1相應(yīng)的階段一致。3 d適應(yīng)性訓(xùn)練之后進行測試階段的實驗。在測試階段，動物有10 min的測試時間，在這10 min內(nèi)，隨機選擇1個隔室給予電刺激。電刺激的程序為：每隔30 s給10 s的電刺激，電壓從0 V遞增至20 V，增幅為4 V（圖2 A），通過箱底部的電極電擊動物的足底。所有實驗動物在測試完1個電壓水平后再進行下一水平電壓的測試。

1．2．3樹鼩條件恐懼記憶的建立（實驗3）

該實驗由4個階段組成：適應(yīng)階段、刺激前記錄階段、給予一刺激形成恐懼記憶階段、恐懼記憶維持階段。適應(yīng)階段的處理和實驗2適應(yīng)階段一致。在恐懼記憶形成階段，將一適合的刺激電壓電擊動物足底以形成條件恐懼，該階段共持續(xù)5 d（圖3，0～4 d），每天每只動物記錄1次。該階段結(jié)束后刺激即移除，記錄繼續(xù)即過渡到恐懼記憶維持階段。在所有實驗中，明暗箱的選擇是隨機的。刺激程序為：10 min內(nèi)每隔30 s給予10 s一合適恒壓電刺激。對照組不給刺激。

1．2．4樹鼩條件恐懼記憶的抹除（實驗4）

在實驗組動物形成條件恐懼7周后，啟動記憶抹除實驗。該實驗包括3個階段即條件恐懼記憶維持階段、恐懼記憶抹除階段和記憶抹除后維持階段。在恐懼記憶抹除階段，在明箱中給予一適合刺激電擊動物的足底，觀察條件恐懼消退情況。該階段共持續(xù)4 d（圖4，0～3 d），每只動物每天記錄1次，該階段結(jié)束后則過渡到下一階段即記憶抹除后維持階段。在所有實驗中，明暗箱的選擇是隨機的。刺激程序為：10 min內(nèi)每隔30 s給予10 s一合適恒壓電刺激。對照組不給刺激。

1．2．5數(shù)據(jù)收集

實驗均在14∶00～18∶00之間進行的。在測試階段的10 min內(nèi)，動物在每個隔間內(nèi)的活動情況由攝像機記錄，通過行為學(xué)分析軟件EthoVision XT 9（荷蘭瓦赫寧根大學(xué)Noldus公司）進行分析，統(tǒng)計出動物在每個間隔內(nèi)的停留時間、移動速度、移動距離等。當樹鼩通過兩隔室間隔板時，規(guī)定以動物的中心為參考點進行統(tǒng)計處理。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2．1樹鼩明暗箱活動規(guī)律探索

在沒有任何刺激情況下，讓樹鼩（n＝4）在明暗箱中自由活動。結(jié)果表明，樹鼩在暗箱中停留時間為（476．773± 26．965）s，而明箱中只有（117．075±31．176）s。在暗箱中的停留時間是明箱中的4倍多，這表明，日常生活中，樹鼩更喜歡在暗箱中停留（t＝6．281，P＜0．01）。

2．2樹鼩足底電擊合適電壓的探究

在兩相同的明室中，一室內(nèi)給予不同電壓足底電擊，樹鼩（n＝6）表現(xiàn)出不同的活動特征。0、4、8 V電壓下，樹鼩在2個隔室中的停留時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0．05）。當電壓增大到12 V時，樹鼩在有電刺激的隔間停留時間與0 V時的停留時間比較開始明顯縮短（t＝3．429，P＜0．05）。隨著刺激電壓的加大，樹鼩在有電刺激的隔間停留時間越來越少［16 V（t ＝5．763，P＜0．01）、20 V（t＝7．117，P＜0．001）］，見圖2B。樹鼩的其他活動指標如移動距離在6個電壓梯度下差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。移動速度在16 V前差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），20 V時移動速度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝3．176，P＜0．05）。為了獲得顯著差異結(jié)果并且對樹鼩動物福利的保護，在接下來的實驗中選用16 V電壓進行刺激。

2．3樹鼩條件恐懼記憶的形成

動物隨機分為實驗組（n＝4，暗箱中給予足底電刺激）和對照組（n＝4，無電刺激）。結(jié)果顯示，在刺激前，實驗組樹鼩在明箱中停留時間所占比例約為16．67%，而對照組的約為23．44%，兩者比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；在記憶形成階段，實驗組樹鼩在沒有電刺激的明箱中的停留時間逐漸增加，與對照組比較前2 d （0～1 d）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），第3天以后差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而對照組無變化。隨著刺激的繼續(xù)，實驗組樹鼩在明箱中停留的時間逐漸增加，穩(wěn)定后實驗組樹鼩在明箱中的停留時間隨天數(shù)的變化與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義［F（22，132）＝7．690，P＜0．001］，表明恐懼記憶已形成。見圖3。

2．4樹鼩條件恐懼記憶的抹除

在結(jié)束恐懼記憶維持階段后，啟動記憶抹除實驗。實驗動物分組不變，但與恐懼記憶形成實驗不同的是實驗組是在明箱中給予16 V的足底電擊。結(jié)果顯示，在抹除刺激施加前，實驗組樹鼩在明箱中停留時間所占比例約為83．8%而對照組約為20．19%，兩者比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；在恐懼記憶抹除階段，實驗組樹鼩在有電刺激的明箱中的停留時間逐漸減少，而對照組無變化。最后穩(wěn)定在與對照組無差別水平，兩組樹鼩在明箱中停留時間隨天數(shù)的變化無統(tǒng)計學(xué)意義［F（11，66）＝1．641，P＞0．05］，表明抹除階段過后，實驗組動物的條件恐懼記憶被完全抹除，樹鼩條件恐懼記憶的抹除過程見圖4。

3　討論

研究［6］表明，樹鼩是一種晝行性動物。但實驗1結(jié)果表明，樹鼩更喜歡呆在暗箱中而不是停留在明箱中?？赡苁且驗闃潼毮懽颖容^小，在暗箱中停留較多時間符合樹鼩的活動特征。

學(xué)習(xí)記憶是一種高級的神經(jīng)活動［3，7］。動物等級越高，其學(xué)習(xí)記憶功能就越復(fù)雜。痛覺和恐懼是通過不同的方式進行編碼的，但是有些地方是有交集的。比如痛覺刺激對恐懼記憶的形成有深遠的影響［8－9］。因此，足底電擊是進行恐懼記憶研究最常用的手段［10］。對樹鼩學(xué)習(xí)記憶方面的研究如水迷宮實驗［11］，或食物誘導(dǎo)［12－13］，但這些實驗都只能從某些方面測試樹鼩的學(xué)習(xí)記憶能力，對條件恐懼的痛覺記憶目前還沒有很好的實驗方法來檢測。樹鼩作為靈長類的近親，腦部的發(fā)育比嚙齒類更接近于人類［2］。本研究進行了足底電擊誘導(dǎo)條件恐懼記憶的形成及抹除實驗。實驗2探討樹鼩足底電擊的合適電壓。結(jié)果表明，樹鼩對12 V的電壓就有一定的反應(yīng)，但速度的明顯變化是在16 V以上。綜合各方面的因素及動物福利，將誘導(dǎo)條件恐懼的足底電擊電壓定在16 V。

巴普洛夫恐懼記憶理論認為，恐懼記憶的形成經(jīng)歷3個階段：誘導(dǎo)與建立、強化和維持、消退［14］。本實驗采用足底電擊刺激樹鼩誘導(dǎo)其建立對暗箱的條件恐懼記憶，結(jié)果顯示樹鼩的這種條件恐懼記憶存在時間超過8周而未消退。研究［8］表明新的重大刺激能夠使人或動物忘記原有的恐懼記憶，因此在記憶抹除階段，在相反的箱子給予樹鼩刺激，以期樹鼩能夠抹除其恐懼記憶。結(jié)果顯示，在相反的箱子給予刺激后，樹鼩選擇性地抹除原來對暗箱的恐懼記憶，在隨后的維持階段并不是新舊兩種記憶共存，而是徹底地抹除了恐懼記憶。本實驗顯示，新的重大環(huán)境變化可以抹除某些恐懼記憶，這就為將來治療恐懼癥提供了一個方向。

由于實驗規(guī)模的限制，本實驗未能對恐懼記憶形成的分子機制進行研究。在將來的研究中，將著重對恐懼記憶形成及抹除的分子機制展開探索，為將來臨床上治療恐懼癥提供理論指導(dǎo)。

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文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1426－05

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81071075）；生物膜與膜生物工程國家重點實驗室開放課題

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，合肥2300322北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物膜與膜生物工程國家重點實驗室，北京100871

作者簡介：郭呈斌，男，碩士研究生；王烈成，男，教授，博士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：wangliecheng＠ahmu．edu．cn動物被允許進行環(huán)境及實驗節(jié)奏的適應(yīng)，共持續(xù)3 d；在實驗階段，每只動物進行10 min的測試（每次測試記錄前有3 min的適應(yīng)時間以消除應(yīng)激反應(yīng)帶來的誤差）。訓(xùn)練階段和適應(yīng)階段的數(shù)據(jù)不做統(tǒng)計。實驗中隨機使用1個隔室作為暗箱以消除系統(tǒng)誤差。每次實驗結(jié)束后每只樹鼩有1小塊糖果（約5 g）作為獎勵。

A novel fear conditioning memory model formation and erasing by foot-shock in tree shrew

Guo Chengbin1，Zhang Chen1，2，Wang Liecheng1
（1Dept of Physiology，School of Basic Medical Science，AnhuiMedical University，Hefei230032；2State Key Laboratory of Biological Membrane and Membrane Biological Engineering，College of Life Sciences，Peking University，Beijing100871）

AbstractObjectiveTo investigate the way of fear conditioning memory model evoked and erased by foot-shock in tree shrew．MethodsFirst，detect the tree shrew activities regularly in light／dark box．Second，testa suitable voltage degree of foot shock on tree shrew．Third，investigate thememory formation and erasing of fear conditioning on tree shrew of trial group．Resu ltsThe duration of tree shrew（n＝4）stay in the dark-box was significantly longer than that of in the light box（P＜0．01）in normal condition．In the same environment of two light boxes，given different voltage degrees，the durations of tree shrew（n＝6）stay in the stimulating chamber gradually reduced and the durations of tree shrew stay had significant difference between stimulatus chamber and no stimulatus chamber when the stimulus voltage up to 12 V（P＜0．05），16 V（P＜0．01）and 20 V（P＜0．01）．The animal of trial group（n＝4）could build up the fear conditioningmemory of the dark box with the stimulus of 16 V foot-shock in the dark box（P＜0．001）．After formation of the fear conditioning memory，the same stimulus in light box appeared for 4 days．The durations of tree shrew stay in trial group（n＝4）decreased in light box，and there was nosignificant difference between the trial group and the control group．ConclusionTree shrew prefers to stay in the dark box．The suitable voltage for foot-shock on tree shrew is 16 V．The fear conditioningmemory can be evoked and erased by foot-shock．

Key wordstree shrew；foot-shock；fear conditioningmemory formation and erasing；light／dark box