椆樹桑寄生多糖提取工藝優化

廖日權，鐘秋平，許蘭仙（.欽州學院海洋學院，廣西欽州535000；.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川7500）

椆樹桑寄生多糖提取工藝優化

廖日權1，鐘秋平1，許蘭仙2
（1.欽州學院海洋學院，廣西欽州535000；2.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川750021）

摘要：以椆樹桑寄生樹葉為原料，對植物多糖提取的影響因素及工藝進行優化研究。采用熱水浸提方法，分析提取溫度、時間、料液比和醇降濃度對提取椆樹桑寄生植物多糖的影響。采用硫酸-苯酚法測定椆樹桑寄生植物多糖，根據L9（34）正交試驗優化確定椆樹桑寄生多糖最優提取條件為：提取溫度為80℃、料液比為1∶20（g/mL）、提取時間為2.0 h，乙醇醇降濃度為70%。在此條件下，椆樹桑寄生多糖提取率為1.7%。

關鍵詞：椆樹桑寄生；多糖；提取工藝；正交試驗

椆樹桑寄生（Loranthus delavayiVan TieghDanser）又名廣寄生、寄生茶，為桑寄生科鈍果寄生屬植物，可寄生于海拔500 m～3 000 m山谷、山地常綠闊葉林中，常寄生于殼斗科植物上。我國主要分布于西藏（察隅）、云南、廣西、福建等地[1]。該藥材味苦、甘，性微溫，功效主治為祛風濕、補肝腎、續骨，主治風濕痹證、腰膝疼痛、骨折[2]。目前，國內外學者從椆樹桑寄生科植物的提取物中分離到多種化學成分，研究表明該植物多種成分具有抗腫瘤等活性[3-6]。

同時，許多植物多糖具有生物活性，它們具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、抗菌抗病毒、保護肝臟等保健作用[7-10]。但到目前為止，通過查閱文獻發現國內外尚沒有學者對椆樹桑寄生植物多糖提取工藝進行研究。因此本研究以廣西河池地區的椆樹桑寄生樹葉為研究對象，以水溶性多糖得率為指標，對椆樹桑寄生植物多糖的提取工藝進行了單因素試驗和正交試驗研究，探討其植物多糖提取最佳工藝條件，為開發廣西的椆樹桑寄生資源提供科學參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

椆樹桑寄生植物1 000 g，采摘于廣西河池市，由欽州學院鐘秋平副教授鑒定。

1.1.2試劑

葡萄糖、濃硫酸、苯酚、95%乙醇、氯仿、正丁醇，所有試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器

BL610型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；可見分光光度計：北京普析通用儀器設備有限責任公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室開發有限公司；電熱鼓風干燥箱：上海智城分析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1多糖的制備

準確稱取椆樹桑寄生樹葉干粉100 g，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水1 000 mL，80℃水浴浸提120 min，抽濾；濾渣重復提取兩次，合并3次濾液，過濾，沉淀，4 000 r/min離心10 min，在旋轉蒸發儀上進行真空濃縮，然后向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇，沉淀10 h，再3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，有機溶劑洗滌沉淀兩次，真空干燥沉淀物，得椆樹桑寄生粗多糖。

將干燥的椆樹桑寄生粗多糖用蒸餾水溶解，活性炭75℃水浴100 min，間歇攪拌，4 000 r/min離心10 min，上清液中加入2.4倍體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），振蕩后靜置30 min，4 000 r/min離心10min，取上清液，減壓蒸餾濃縮，95%乙醇醇析，提取到椆樹桑寄生多糖沉淀，用無水乙醇反復洗滌2次～3次，真空干燥后得精制樹桑寄生多糖多糖備用。

1.2.2苯酚-硫酸法測定多糖含量

1.2.2.1測定波長的確定

配制一定濃度的椆樹桑寄生植物多糖溶液和葡萄糖標準溶液，精密量取1.0 mL于石英比色皿中，根據多糖與苯酚-濃硫酸試劑發生特異性反應[10]，以等量的蒸餾水作空白，在UV-3200紫外可見分光光度計上從400 nm～700 nm進行掃描，確定椆樹桑寄生植物多糖和葡萄糖的最大吸收波長為490 nm。

1.2.2.2標準曲線的制作

將葡萄糖配制成0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL系列標準溶液，采用苯酚-硫酸法于490 nm處測量吸光度。以葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=3.538 9C-0.006 2（R2=0.999 3）。

1.2.2.3換算因子的測定

準確稱取干燥恒重椆樹桑寄生多糖50.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，作為多糖儲備液。吸取0.2 mL，加水至1 mL。按1.2.2.2步驟測定吸光值，重復3次。按照如下公式計算換算因子f。

式中：W為椆樹桑寄生多糖的質量，mg；C為椆樹桑寄生多糖溶液中葡萄糖濃度，（mg/mL）；D為稀釋因子，mL。取3次測量平均值，計算得f=2.35。

1.2.2.4苯酚-硫酸法計算多糖提取率

按照1.2.6中步驟，將沉淀的多糖用蒸餾水溶解后定容，按1.2.2.2步驟測其吸光值，根據標準曲線與換算因子計算椆樹桑寄生葉多糖提取率。

椆樹桑寄生多糖提取率（%）=C×D f/W×100

式中：C為椆樹桑寄生多糖溶液中葡萄糖濃度，（mg/mL）；D為稀釋因子，mL；f為換算因子；W為椆樹桑寄生樣品質量，mg。

1.2.4影響多糖提取效果的單因素試驗

準確稱取椆樹桑寄生葉干粉1.00 g，置于比色管中，加入一定體積蒸餾水，水浴加熱浸提一定時間，提取液減壓過濾，濾渣重復浸提步驟3次；合并濾液，減壓蒸餾，濃縮液醇沉得多糖，多糖經蒸餾水溶解、定容，測定椆樹桑寄生多糖含量并計算提取率。分別以提取溫度、提取時間、料液比和醇降濃度4個因素為對象，考察其對椆樹桑寄生多糖提取率的影響。

1.2.5椆樹桑寄生多糖提取的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以提取溫度、提取時間、料液比和乙醇濃度四因素三水平進行L9（34）正交試驗，優化多糖的提取工藝。水平表見表1。

表1　椆樹桑寄生植物多糖提取工藝優化正交試驗因素水平表Table 1　Factors and levels of orthofonal test of polysaccharide of Loranthus delavayiVan TieghDanser

1.2.6驗證試驗

為了進一步考察優選工藝的可靠性和穩定性，精密稱取1.0 g椆樹桑寄生葉粉末，在1.2.5確定的工藝條件下進行3次試驗，驗證所提取條件優化的穩定性。

2　結果

2.1單因素的優化

2.1.1醇降濃度對多糖提取效果的影響

醇降濃度對多糖提取效果的影響見圖1所示。

圖1　乙醇濃度對多糖提取率的影響Fig.1　The effect of alcohol concentration on polysaccharide extraction rate

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增大，多糖提取率增大，濃度在70%時，提取效果最好；隨后，多糖提取率隨乙醇濃度的增加，多糖提取率下降。

2.1.2料液比對多糖提取效果的影響

料液比對多糖提取效果的影響見圖2所示。

由圖2可知，隨著液料比減小，多糖提取率首先增加，在液料比為1∶20（g/mL）時，多糖提取率最大；過了1∶20（g/mL）多糖提取率呈下降的趨勢。

2.1.3提取溫度對多糖提取效果的影響

提取溫度對多糖提取效果的影響見圖3所示。

圖2　料液比對多糖提取率的影響Fig.2　The effect of solid-liquid ratioe on polysaccharide extraction rate

圖3　提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3　The effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

由圖3可知，隨著提取溫度的提高多糖提取率增加，溫度在80℃時，提取效果最好；隨后，多糖提取率隨提取溫度的升高而降低。

2.1.4提取時間對多糖提取效果的影響

提取時間對多糖提取效果的影響見圖4所示。

圖4　提取時間對多糖提取率的影響Fig.4　The effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

圖4可知，多糖提取率隨提取時間的延長而升高，當時間超過2 h后，提取率呈下降趨勢。試驗表明2 h時為最佳提取時間，提取效果最好。

2.2正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以提取溫度、提取時間、料液比和醇降濃度為考察因素，各取3個水平，設計正交試驗表（表1），對椆樹桑寄生多糖提取工藝進行優化，優化結果見表2。

表2　椆樹桑寄生多糖提取工藝優化L9（34）正交試驗設計及結果Table 2　The results of orthofonal test on polysaccharide of Loranthus delavayiVan TieghDanser

由極差R值可知，各考察因素對椆樹桑寄生多糖提取效果的影響程度為提取溫度＞料液比＞提取時間＞醇降濃度。從K值來看，A因素列極差K2＞K3＞K1，B因素列極差K2＞K3＞K1，C因素列極差K2＞K1＞K3，D因素列極差K1＞K3＞K2，因此確定椆樹桑寄生植物多糖法水提醇降法最佳提取工藝條件為：A2B2C2D1，即提取溫度80℃，提取時間2.0 h，料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度為70%。

2.3驗證試驗結果

為了進一步考察優選工藝的可靠性和穩定性，精密稱取1.0 g椆樹桑寄生植物粉末，在上述確定的最優工藝條件下進行3次平行提取試驗，測提取多糖提取率分別為1.66%、1.73%和1.72%，平均值約為1.7%。試驗表明，此工藝穩定、重復性較好。

3　結論

利用水提醇降法提取多糖具有能耗低、省時、不破壞有效成分等優點，該工藝合理、成熟，有較高的開發價值。通過單因素實驗以及正交試驗，試驗提取出各因素對椆樹桑寄生多糖提取效果的影響程度為提取溫度＞料液比＞提取時間＞醇降濃度。確定椆樹桑寄生植物多糖法水提醇降法提取多糖最佳工藝條件為：提取溫度80℃，提取時間2 h，料液比1∶20（g/mL），醇降濃度為70%。

參考文獻：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.012

收稿日期：2014-11-20

基金項目：欽州學院科研項目（2013XJKY-10B）；廣西高校科學技術研究項目（KY2015LX537）

作者簡介：廖日權（1982—），男（漢），實驗師，碩士研究生，主要從事海洋藥物及海洋環境化學研究。

The Extraction Process of Polysaccharide from Loranthus delavayiVan Tiegh

LIAO Ri-quan1，ZHONG Qiu-ping1，XU Lan-xian2
（1.Marine School of Qinzhou University，Qinzhou 535000，Guangxi，China；2.School of Biological Sciences and Engineering of Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Abstract：The polysaccharide was extracted from the leaf of Loranthus delavayiVan TieghDanserp in Guangxi，and the extraction process was studied by single factor and orthogonal experiment.With water as extraction solvent，the effect of extraction temperature，extraction time，solid-liquid ratio and alcohol concentration on the yield of polysaccharide were optimized with single factor test followed by four factor-four level orthogonal experiment.The result showed that the optimal extraction conditions of polysaccharide were：the extraction temperature was 80℃，the solid-liquid ratio was 1∶20（g/mL），the extraction time was 2 h and the alcohol concentration was 70%.Under these conditions the polysaccharide extraction yield was 1.7%.

Key words：Loranthus delavayiVan Tiegh，polysaccharide，extraction process，orthogonal experiment