金銀花抗自由基能力的檢測

樊　琛，杜　曉，程　霜，李　燕，劉桂芹，曾慶華（聊城大學農學院，山東聊城252059）

金銀花抗自由基能力的檢測

樊琛，杜曉，程霜，李燕，劉桂芹，曾慶華
（聊城大學農學院，山東聊城252059）

摘要：對金銀花抗多種自由基能力進行檢測。通過正交試驗分析溶劑濃度、料液比、處理時間以及提取溫度等對金銀花提取物清除自由基能力的影響。不同處理的金銀花提取物均對2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS+·）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和超氧陰離子自由基（O2-·）有明顯的清除作用，對羥基自由基（HO·）的清除作用較小。金銀花提取物對各種自由基具有清除能力。

關鍵詞：金銀花；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基；2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基

金銀花為忍冬科植物忍冬的花蕾[1]，它屬我國公布的既是食品又是藥品的植物，具有清熱解毒、疏風通絡等功效[2]。金銀花中有揮發油、黃酮類、有機酸、三萜類、無機元素等多種類型的化學成分[3]。有研究表明，綠原酸類和黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基的作用。目前，國內研究金銀花抗氧化性主要是對抗氧化成分綠原酸和類黃酮中的一種進行研究，而對金銀花總抗氧化成分進行研究的較少。

本文以金銀花為原料，運用正交試驗法，以料液比、提取時間、乙醇濃度、提取溫度為因素，提取金銀花中總抗氧化成分，并研究不同溶劑提取物對自由基的清除作用，為金銀花的綜合利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金銀花：北京同仁堂健康藥業（福州）有限公司，無腐爛、無蟲蛀。

乙醇、乙酸乙酯、NaNO2、水楊酸、H2O2、FeSO4、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、HCl均為分析純；蘆丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：sigma公司；2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：生工生物工程（上海）有限公司。

1.2儀器與設備

UV-1700紫外可見分光光度計：日本島津公司；SK1200H超聲清洗機：上海科導超聲儀器有限公司；79-2雙向磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市醫療儀器廠；SB-2000水浴鍋：上海愛朗儀器有限公司；TD5臺式多管架離心機：長沙英泰儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理

稱取干金銀花樣本，用研缽研成粉末，懸于溶劑中，超聲處理浸提后抽濾，濾液于3 000 r/min離心15 min后，置于冰箱中保藏，備用。

1.3.2正交試驗的設計

依據單因素預試驗的結果，確定選取四因素三水平條件，分別為：料液比、提取時間、溶劑（乙醇）濃度、提取溫度。其中，料液比（g/mL）為1∶200、1∶300、1∶400，提取（超聲處理45 W）時間為15、30、45 min，乙醇濃度為0%、30%、60%，提取溫度為20、40、60℃。按上述條件選取L9（34）正交試驗設計表，如表1。分別檢測提取物清除自由基（HO·、O2-·、ABTS+·、DPPH·）的能力。

表1　正交試驗設計表Table 1　Orthogonal test

1.3.3體外抗自由基試驗

1.3.3.1清除HO·能力的測定[4-6]

采用Fenton反應體系法，2 mL 1.96 mmol/L H2O2，2 mL 1.8 mmol/L FeSO4和2 mL 1.8 mmol/L水楊酸-乙醇，0.1 mL樣品溶液。其中，H2O2最后加入并啟動整個反應。反應體系37℃反應30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm處測量溶液的吸光度值。以蒸餾水代替樣品溶液作空白對照。每個試樣作3個平行，取其平均值。根據下式計算HO·清除率：

K/%=[A0-（AX-A1）]/A0×100

式中：A0為空白對照組的吸光度；AX為加入樣品溶液后的吸光度；A1為不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光度值；K為清除率。

1.3.3.2清除O2-·能力的測定[7-9]

采用鄰苯三酚自氧化法。取1 mmol/L的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液（pH 8.2）4.5 mL，置25℃水浴中預熱20 min后，分別加入1 mL試樣溶液和0.4 mL 5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入1.6 mmol/L HCl 1 mL終止反應，用紫外-可見分光光度計在波長325 nm處測定溶液的吸光度（AX）。空白對照組以相同體積的蒸餾水代替樣品溶液，用紫外-可見分光光度計在波長325 nm處測定溶液的吸光度（A0），每個試樣作3個平行，取其平均值。數據代入下式計算清除率。

式中：A0為空白對照組的吸光度值；AX為加入樣品溶液后的吸光度值；A1樣品空白的吸光度值；K為清除率。

1.3.3.3清除ABTS+·能力的測定[10-12]

將2 mL樣品溶液加入2 mL稀釋后的ABTS溶液中，記錄7 min時反應溶液在734 nm處的A值，記為AX。空白對照組為浸提溶劑與ABTS溶液混合。清除率公式如下：

式中：A0為空白對照液的吸光度值；AX為加入樣品溶液后的吸光度值；A1為樣品空白的吸光度值；K為清除率。

1.3.3.4清除DPPH·能力的測定[12-13]

將DPPH以無水乙醇配制成0.2 mmol/L的溶液，分別吸取2 mL的樣品溶液和2 mL的DPPH，避光混勻，反應30 min于517 nm處測定吸光度值AX。空白對照組為浸提溶劑與DPPH溶液混合。清除率公式如下：

式中：A0為空白對照組的吸光度值；AX為加入樣品溶液后的吸光度值；A1為樣品空白的吸光度值；K為清除率。

2　結果與分析

2.1正交試驗

以料液比、超聲波處理時間、浸提溶劑的濃度、提取溫度為正交因素，正交試驗L9（34）結果見表2～表5。

表2　HO·正交試驗結果Table 2　Results of HO·orthogonal test

續表2　HO·正交試驗結果Continue table 2　Results of HO·Orthogonal test

表3　O2-·正交試驗結果Table 3　Results of O2-·orthogonal test

表4　ABTS+·正交試驗結果Table 4　Results of ABTS+·orthogonal test

表5　DPPH·正交試驗結果Table 5　Results of DPPH·orthogonal test

由表2可知，影響清除羥基自由基能力的各因素的主次順序是：料液比﹥乙醇濃度﹥提取溫度﹥提取時間。最佳組合為A1B2C1D1，即料液比為1∶200（g/mL）、提取時間為45 min、乙醇濃度為60%、提取溫度為60℃。經驗證，此條件下，清除率為3.08%。

由表3可知，影響清除超氧陰離子自由基能力的各因素的主次順序是：乙醇濃度>提取時間>料液比>提取溫度。清除超氧陰離子自由基能力最佳的組合為A2B3C1D2，即料液比為1∶300（g/mL）、提取時間為15min、乙醇濃度為60%、提取溫度為40℃，清除率為19.58%。

如表4可知，各組金銀花提取物均對ABTS＋·有較強的清除作用。影響較大的因素是提取時間和提取溫度，時間越長，溫度越高，清除率越大。其次，乙醇濃度增大，清除率增大；料液比增大，清除率先增大后減小。最佳組合為A2B2C1D1，即料液比為1∶300（g/mL）、提取時間為45 min、乙醇濃度為60%、提取溫度為60℃，經驗證，此條件下，清除率為99.38%。

由表5可知，影響清除DPPH自由基能力的各因素的主次順序是：乙醇濃度>料液比>提取時間>提取溫度。最佳組合為A1B2C3D1，即料液比為1∶200（g/mL）、提取時間為45 min、乙醇濃度為0、提取溫度為60℃，經驗證，此條件下，清除率為92.36%。

3　結論

金銀花提取物對HO·、O2-·、DPPH·、ABTS＋·4種自由基均有清除作用。其中，對DPPH·、ABTS＋·兩種自由基的清除能力強，對O2-·的清除能力次之，而對HO·的清除能力弱。提取物清除各自由基的最佳提取條件差異較大。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.036

收稿日期：2013-10-24

基金項目：聊城大學博士科研啟動基金（31805）

作者簡介：樊琛（1978—），女（漢），副教授，博士，主要從事食品營養與衛生學方向的研究。

Detection of Flos Lonicerae Anti-radical Ability

FAN Chen，DU Xiao，CHENG Shuang，LI Yan，LIU Gui-qin，ZENG Qing-hua
（Agricultural School，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China）

Abstract：This paper detects anti-radical ability of Flos Lonicerae.Effects of solvent concentration，solidliquid ratio，extraction time and extraction temperature on extractive scavenging radicals were investigated by orthogonal test.The results showed that each group of extractive had a scavenging capacity on 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·），2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）radical（ABTS+·）and superoxide radical（O2-·），but had a small scavenging capacity on hydroxyl radical（HO·）.Flos Lonicerae extractive showed scavenging radicals activity.

Key words：Flos Lonicerae；1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）radical；2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）（ABTS）radical