奶粉中蛋白質含量的快速測定

汪菊，付大友，徐晨曦（四川理工學院材料與化學工程學院，四川自貢643000）

奶粉中蛋白質含量的快速測定

汪菊，付大友，徐晨曦
（四川理工學院材料與化學工程學院，四川自貢643000）

摘要：從奶粉中蛋白質的快速檢測方法入手，選取了分光光度法中的考馬斯亮藍G-250來進行研究。結果表明，在酸性介質中，蛋白質與考馬斯亮藍G-250溶液反應生成藍色絡合物。該絡合物最大吸收波長為594 nm，摩爾吸光系數為3.75×10-5L/（mol·cm），精密度（RSD）為0.55%，相關系數為0.999 3，加標回收率為97.8%。

關鍵詞：蛋白質；考馬斯亮藍G-250；分光光度法

奶粉中含有豐富的蛋白質，是人們日常生活中補充蛋白含量不可缺少的來源，并且它的水分含量低，使得比其他奶制品具有更好地運輸和儲存能力[1]。但近幾年奶粉安全事件時有發生，一些不法商販為了謀利，常向奶粉中添加一些含氮量高的非蛋白質物質來提高蛋白質含量，這些物質極有可能會對人體造成傷害，如三聚氰胺等。因此，快速、準確地測定奶粉中蛋白質的含量至關重要[2]。目前，對奶粉中蛋白質含量測定的方法已有很多種方法。凱氏定氮法是測量蛋白質含量的經典方法，但此方法步驟繁瑣，耗時耗力。本試驗是采用紫外分光光度法測定奶粉中蛋白質含量，采用考馬斯亮藍G-250作為顯色劑，考馬斯亮藍法是利用蛋白質-染料結合的原理進行染色，定量的測定蛋白質濃度[3]。此法操作簡單，快速，靈敏度較高，可以得到滿意的結果。

1　試驗原理

1976年，Bradfo rd等建立一種測定蛋白質的考馬斯亮藍法（Bradford法），它是根據考馬斯亮藍G-250染料所含的疏水基團在酸性條件下與蛋白質的堿性氨基酸特別是精氨酸及芳香族氨基酸殘基通過疏水作用結合形成藍色蛋白質染料復合物[4]，使染料最大吸收峰的位置（Kmax）由465 nm變為595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色的原理設計的[5]。波長在595 nm條件下，所測定吸光度與蛋白質濃度成正比。

2　材料與方法

2.1材料與儀器

2.1.1儀器

UV-2000紫外可見分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公司；AR1140分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；石英比色皿、比色管及容量瓶等玻璃儀器。

2.1.2材料

2.1.2.190%乙醇溶液

移取90 mL無水乙醇于100 mL容量瓶中，定容至刻度。

2.1.2.2考馬斯亮藍G-250溶液（0.1 mg/mL）

稱取0.100 0 g考馬斯亮藍G-250于100 mL燒杯中，用50 mL 90%乙醇溶解，轉入至1 000 mL容量瓶中，在此容量瓶中加入100 mL 85%磷酸，用水定容至刻度，該溶液在常溫下可放置1個月。

2.1.2.3牛血清蛋白溶液（100 μg/mL）

稱取0.010 0 g牛血清蛋白于100 mL燒杯中，溶解，轉入至100 mL容量瓶中，定容至刻度。

2.2方法

2.2.1牛血清蛋白的標準曲線

分別移取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 100 μg/mL牛血清蛋白溶液于6支比色管中，補水至1.00 mL，5.00 mL 0.1 mg/mL考馬斯亮藍G-250溶液，加入1.50 mL 85%磷酸溶液，搖勻，然后在波長為594 nm下進行測定。此時注意溶液必須在6 min內測定完。

2.2.2樣品測定

稱取0.010 0 g奶粉于100 mL燒杯中，溶解，轉入至100 mL容量瓶中，定容至刻度，作為待測液。然后移取1.00 mL待測液于25 mL比色管中，然后按2.2.1步驟進行。

3　結果與分析

3.1磷酸最佳量

移取0.40 mL牛血清蛋白溶液于6支比色管中，補水0.60 mL，5.00 mL考馬斯亮藍G-250溶液，再分別加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 85%磷酸溶液，然后按2.2.1步驟進行，結果見圖1。

圖1　磷酸最佳量Fig.1　The optimal amount of phosphate

由圖1可知，加入1.5 mL 85%磷酸，吸光度達到最大，此時磷酸用量最佳。這是由于磷酸用量太少，溶液顯色效果不明顯，但是磷酸加入量過多，使得溶液顏色過深而影響測量，導致吸光度偏小。

3.2考馬斯亮藍G-250最佳量

移取0.40 mL牛血清蛋白溶液于6支比色管中，補水0.60 mL，分別加入2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00 mL考馬斯亮藍G-250溶液，然后按2.2.1步驟進行，結果見圖2。

圖2　考馬斯亮藍G-250最佳量Fig.2　The optimal amount of Bradford G-250

圖2表明，當加入4.00 mL～6.00 mL顯色劑考馬斯亮藍G-250時，吸光度達到穩定。說明此時考馬斯亮藍G-250與牛血清蛋白所形成的復合物達到穩定狀態，因此考馬斯亮藍G-250的最佳用量為5.00 mL。

3.3最佳顯色時間

移取0.40 mL牛血清蛋白溶液于比色管中，然后按2.2.1步驟進行，分別反應2、4、6、10、15、20 min后，測定，結果見圖3。

圖3　最佳顯色時間Fig.3　The optimal amount of chromogenic time

根據圖3顯示，顯色時間在2 min～6 min時，吸光度達到最穩定。說明時間對其所形成的復合物有一定性的影響，因此溶液必需在6 min中內測定。

3.4牛血清蛋白的標準曲線

圖4是以牛血清蛋白含量為橫坐標，所測吸光度為縱坐標，在波長λ=594 nm下所得到的標準曲線，其方程為：y=0.004 5x+0.006 1，R2=0.999 3。

3.5精密度及回收率

精密度及回收率見表1。

圖4　牛血清蛋白的標準曲線Fig.4　Standard curve of bovine serum albumin

表1　精密度及回收率Table 1　The precision and recovery

由表1可以看出，測定結果的相對標準偏差為RSD=0.55%。從此方法測定結果的均值和RSD值來看，該法的重現性好，精密度理想。并且此方法平均回收率達標，表明此法可行。

3.6樣品測定

樣品測定結果見表2。

表2　奶粉測定結果Table 2　The results determined by formula

由表2可知，B奶粉中的蛋白質含量比A奶粉高7.08%，兩種奶粉中蛋白質含量相差不大。并且兩種奶粉的測定結果與實際所買奶粉蛋白質含量最大相差0.14%，在誤差允許范圍內，因此測定結果基本符合要求。

4　結論

考馬斯亮藍法由于靈敏度高、測定快速簡便、干擾物質少等優點，得到廣泛應用。此方法除測定奶粉等牛乳中蛋白質含量外，還可以推廣到其他乳制品及食品等中蛋白質含量測定，但此法中蛋白質與顯色劑所形成的絡合物穩定時間太短，需要進一步研究解決。

參考文獻：

[1]McGoverin C M,Clark A S S,Holroy S E,et al.Raman spectroscopic quantification of milk powder constituents[J].Analytica Chimica Acta,2010,673:26-32

[2]馬麗華,田雨,姜瞻梅,等.雙縮脲法檢測奶粉中總蛋白質快速檢測試紙的研制[J].食品工業科技,2012,33(11):327-329

[3]董娜,賈艷菊,張曉,等.考馬斯亮藍法測定奶粉真蛋白的研究[J].食品安全與檢測,2011,36(11):272-274

[4]宋思遠,李巧玲,劉英華,等.乳及乳制品中蛋白質檢測技術的研究進展[J].江蘇農業科學,2012,40(5):279-282

[5]許家喜.蛋白質的檢測方法與乳制品中蛋白含量測定[J].大學化學,2009,24(1):67

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.036

收稿日期：2014-01-14

基金項目：四川省教育廳重點項目（13ZA0123）

作者簡介：汪菊（1989—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：工業分析。

Study on the Fast Determination Method of Protein Content in Milk Power

WANG Ju，FU Da-you，XU Chen-xi
（College of Materials Chemical Engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Abstract：The rapid determination method of protein was studied.A Bradford G-250 method among spectrophotometric colorimetry was chosen to determine protein content in milk powder.The results showed that the maximum absorption wavelength of protein and Bradford G-250 red-brown generating blue complex was 594 nm in the acidic medium and the apparent molar absorptive was 3.75×10-5L/（mol·cm），the precision （RSD）was 0.55%，the relevant coefficient was 0.999 3，the recovery of standard addition was 97.8%.

Key words：protein；Bradford G-250；spectrophotometry