角鯊烯的高效液相色譜檢測法

陳偉珠，晉文慧，張怡評，洪專，*（.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門36005；2.廈門大學化學化工學院化學系，化學生物學福建省重點實驗室，福建廈門36005）

角鯊烯的高效液相色譜檢測法

陳偉珠1，2，晉文慧1，張怡評1，洪專1，*
（1.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門361005；2.廈門大學化學化工學院化學系，化學生物學福建省重點實驗室，福建廈門361005）

摘要：建立了一種高效液相色譜法（HPLC）測定角鯊烯含量的檢測方法。采用XBridge RP C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，3.5 μm），流動相為甲醇，流速為1.0 mL/min，檢測器為光電二極管陣列檢測器，檢測波長為210 nm。結果表明，在上述色譜條件下，角鯊烯濃度在2.6 μg/mL～260 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數r為0.999 9。檢出限（S/N=3）為0.33 μg/mL，定量限（S/N=10）為0.99 μg/mL，精密度RSD（n=6）為0.40%；平均加標回收率為100.78%，相對標準偏差為0.75%。方法準確、靈敏、可靠，可用于角鯊烯的定量和定性分析。

關鍵詞：角鯊烯；高效液相色譜；光電二極管陣列法；測定

角鯊烯常溫下為無色油狀液體，是一種高度不飽和脂肪族烴類化合物。其最初是從鯊魚的肝油中發現的，1914年被命名為 Squalene，其化學名稱為2，6，10，15，19，23—六甲基—2，6，10，14，18，22—二十四碳六烯，屬開鏈三萜，又稱魚肝油萜，也稱鯊烯。目前，角鯊烯主要來自于深海鯊魚肝油，同時也少量存在于油脂不皂化物中，尤其在橄欖油、棕櫚油及其脫臭餾出物中含量較多，菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定量角鯊烯。角鯊烯具有提高體內超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強機體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功能，可廣泛地應用于化妝品、醫藥、食品等多個行業[1]。近些年來，很多國家已將其列入藥物行列，如我國藥典中就將角鯊烯作為口服營養藥，劑量為每天1 g。

雖然角鯊烯對人體健康有諸多益處，但也有證據表明過量的角鯊烯會產生一定副作用。科學家給老鼠注射角鯊烯后，發現老鼠患上了免疫系統疾病。目前，人們更多地關注角鯊烯對人體健康帶來的益處，功能性食品市場上此類產品眾多，但是至今為止，我國尚未出臺關于角鯊烯測定的國家標準或者規范性文件。本課題旨在研究角鯊烯含量測定的快速簡便靈敏方法，以對市場日益增多的此類產品提供質量監控手段。目前，關于角鯊烯檢測方法有氣相色譜法[2-8]、氣相色譜-質譜法[9-10]、高效液相色譜法[4，11-14]以及超高效液相色譜法[15]，但分析時間都比較長，一個樣品至少要10 min以上，即使榮維廣[15]建立的超高效液相色譜法，樣品的出峰時間也要9.9 min。本文采用高效液相色譜法對色譜條件進行優化，樣品的分析時間比文獻報道的HPLC法時間短，也比超高效液相色譜法短，且靈敏度高，準確性好，是一種簡便、快速、準確、環保的檢測方法。

1　材料與方法

1.1主要儀器和試劑

1.1.1儀器

Waters 2695高效液相色譜儀配光電二極管陣列檢測器：美國Waters公司；Milli-Q純水機：德國Millipole公司。

1.1.2試驗試劑

甲醇、乙腈（色譜純）；角鯊烯（純度≥99%）：美國sigma公司。

1.2色譜條件

液相色譜柱：XBridge RP C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3標準溶液制備

角鯊烯儲備液的制備：精密稱取角鯊烯16.3 mg，用乙腈溶解，置于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻配成角鯊烯儲備液1630 μg/mL。

2　結果與分析

2.1色譜條件的選擇

2.1.1色譜柱的選擇

角鯊烯，極性很弱，適合用反相色譜柱。所以本試驗選用C18的反相柱。Agilent SB-C18（5 μm，250 mm× 4.6 mm），但是即使流速為2 mL/min，樣品出峰時間約13 min，出峰時間太長。改用XBridge RP C18（250 mm× 4.6mm，3.5μm），流速為1mL/min，出峰時間為7.044min（圖1），比Agilent SB-C18出峰時間短，所以本試驗決定采用XBridge RP C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）作為角鯊烯的分析色譜柱。

圖1　100℃高溫破壞的角鯊烯的色譜圖Fig.1　The chromatography of squalene destroyed by hightemperature

2.1.2流動相的選擇

采用乙腈和甲醇作為流動相體系，試驗結果表明甲醇和乙腈作為流動相，100℃高溫破壞的角鯊烯樣品主峰均能與其它雜質峰分開。但是以乙腈作為流動相，樣品的保留時間較甲醇長，所以本試驗選擇甲醇作為流動相體系。為了考察甲醇/水的不同比例對角鯊烯樣品的分離效果的影響，本試驗在柱溫為35℃和流動相流速為1 mL/min的相同條件下，改變甲醇/水的比例。試驗結果表明（如圖2所示），樣品在甲醇和水不同比例的流動相條件下都能與雜質峰分開，但是隨著水比例從0%增加到5%，樣品的保留時間增加，當水增加到5%時，樣品主峰的保留時間為13.6 min。綜合考慮樣品的保留時間和分離效果，選擇純甲醇作為流動相。

圖2　在不同流動相條件下，100℃高溫破壞的角鯊烯的色譜圖Fig.2　The chromatography of squalene destroyed by hightemperature under the different mobile phase

2.1.3柱溫的選擇

在甲醇作為流動相和流速為1 mL/min的相同條件下，改變柱溫，考察柱溫對分離效果的影響。試驗結果表明（如圖3所示），柱溫為30、35、40℃，樣品保留時間分為為6.7、7.0、7.3 min，且樣品主峰跟其它雜質峰分離良好。綜合考慮樣品的保留時間和柱子的使用壽命，柱溫選擇35℃。

圖3　在不同柱溫條件下，100℃高溫破壞的角鯊烯的色譜圖Fig.3　The chromatography of squalene destroyed by hightemperature under the different column temperature

2.2檢出限與定量下限

將對照品溶液逐級稀釋后，以信噪比S/N=3時的質量濃度為檢出限，S/N=10時的質量濃度為定量下限。計算得出檢出限為0.33 μg/mL，定量限為0.99 μg/mL。

2.3線性關系

取角鯊烯對照品適量，精密稱定13.0 mg，用乙腈溶解，置于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻配成角鯊烯儲備液1 300 μg/mL。精密量取不同體積的儲備液，配制濃度為2.6、6.5、13.0、32.5、130、260 μg/mL的標準工作溶液，精密量取10 μL注入液相色譜儀，以峰面積（Y）對溶液的質量濃度（X）進行線性回歸（如表1所示）。

表1　角鯊烯線性關系測定結果Table 1　The result of linear relation between concentrationof squalene and peak area

結果表明，角鯊烯濃度在2.6 μg/mL～260 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=3500 2X+1962 3 （r=0.999 9）。

2.4精密度與重現性

取2.3項配置的濃度為130 μg/mL的溶液連續進樣6次，結果如表2所示，峰面積的RSD（n=6）為0.40%，表明儀器精密度良好。

2.5溶液穩定性

按“標準溶液的制備”方法配制角鯊烯溶液濃度為144 μg/mL，于室溫（25℃左右）中放置0、2、4、8、12、24 h后分別按優化后的色譜條件進行測定，計算得到RSD（n=6）為0.63%（見表3），表明樣品溶液在室溫條件下能穩定保存。

表2　精密度結果Table 2　The result of precision

表3　穩定性試驗測定結果Table 3　The result of precision

2.6加標回收率

精密稱取不同量的角鯊烯，按照“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，在相當于供試品溶液80%、100%、120%的濃度下，分別考察加標回收率。每個濃度制備3份，以供試品溶液峰面積平均值和對照品溶液峰面積平均值的比值作為回收率。結果見表4。

表4　加標回收試驗Table 4　Result of recovery test

該方法的平均回收率為100.78%，RSD為0.75%，表明方法的回收率良好。

3　結論

本試驗建立了角鯊烯的檢測方法，使用反相柱對角鯊烯含量進行直接檢測，角鯊烯峰與其他雜質峰得到很好分離，且經方法學考察表明，線性關系、精密度、穩定性、重現性、回收率等均符合分析要求，方法準確。

而且該方法的流速不僅比文獻[14]報道的方法低，且樣品的保留時間縮短，節約溶劑和時間，尤其適合高通量樣品的檢測。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.034

收稿日期：2014-07-02

基金項目：福建省科技計劃項目（2015N0009）；廈門海洋研究開發院共建項目（2014）；海洋生物技術產業化中試技術研發公共服務平臺（12PZP001SF10）；廣東海洋經濟發展區域示范項目（GD2012-D01-001）

作者簡介：陳偉珠（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，研究方向：海洋天然產物標準樣品研制與分析。

*通信作者

Determination of Squalene by High Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detector

CHEN Wei-zhu1，2，JIN Wen-hui1，ZHANG Yi-ping1，HONG Zhuan1，*
（1.The Third Instiute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，Fujian，China；2.Department of Chemistry，College of Chemistry and Chemical Engineering，The Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province，Xiamen University，Xiamen 361005，Fujian，China）

Abstract：A high-performance liquid chromatography method for the determination of squalene was developed.The determination of squalene was performed on a XBridge RP C18column（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）.The mobile phase was methanol，and the flow rate was 1.0 mL/min.The detector was photodiode array detector and the variable wavelength detector（VWD）was set at 210 nm.In the above chromatographic conditions，good linear was observed in the linear range of 2.6 μg/mL-260 μg/mL，and the correlation coefficient r was 0.999 9. The limit of detection（LOD）of squalene was 0.33 μg/mL（S/N=3）.The quantitation of detection（QOD）of squalene was 0.99 μg/mL（S/N=10）.The relative standard deviation（RSD）for the accuracy was 0.40%（n=6） and the average recovery was 100.78%with RSD of 0.75%.The method is sensitive，reliable，accurate and could be used for the determination of squalene.

Key words：squalene；high-performance liquid chromatography（HPLC）；photodiode array detector（PAD）；determination