樹莓葉中鞣花酸提取工藝的研究

劉　卉，楊國偉，蘭蓉，馬文志，林峰（北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

樹莓葉中鞣花酸提取工藝的研究

劉卉，楊國偉*，蘭蓉，馬文志，林峰
（北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

摘要：研究樹莓葉中鞣花酸的提取工藝，采用液相色譜法測定鞣花酸含量。設(shè)計以考察乙醇濃度，提取時間，提取溫度，料液比為四因素三水平的正交試驗(yàn)。結(jié)果標(biāo)明：影響鞣花酸提取率的先后順序是：乙醇濃度→提取溫度→提取時間→料液比；最佳提取工藝為乙醇濃度80%，提取時間60 min，提取溫度95℃，料液比3∶140（g/mL）。

關(guān)鍵詞：樹莓；鞣花酸；提取工藝

樹莓（raspberry）是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）多年生落葉性灌木型果樹，又名馬林、木莓、托盤等。樹莓在國際市場上被譽(yù)為“黃金水果”[1]。在北溫帶、亞熱帶分布廣泛。樹莓是我國小漿果樹種之一，其中以東北分布較多，華北、華東及華中地區(qū)也開始種植。樹莓的果實(shí)、莖、根皆可入藥，具有很高的藥用價值，被稱為生命之果。近年來研究發(fā)現(xiàn)，覆盆子（樹莓）是世界上最好的花青素、SOD和鞣花酸來源之一[2]。樹莓不僅被直接用于各類食品加工業(yè)，如果汁、果醬、果粉、果酒、糕點(diǎn)等，而且被開發(fā)運(yùn)用于美容、香精、減肥、染料、醫(yī)藥等多種領(lǐng)域[3]。

樹莓葉中含有多種功能性成分，主要包括酚類物質(zhì)（花青素、鞣花酸和黃酮類等）、人參皂甙、抗壞血酸及微量元素等功能性成分[4-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，樹莓中功效成分具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化、保護(hù)腎功能、減肥和增強(qiáng)免疫力等多種生物學(xué)作用[6-7]。

鞣花酸是樹莓中主要的酚類化合物，個別品種含量超過300 mg/kg。樹莓中游離鞣花酸含量很低，主要是以鞣花單寧形式存在，經(jīng)酸水解釋放鞣花酸[8]。鞣花酸能抵抗多環(huán)芳香碳?xì)浠衔?、亞硝胺、毒枝菌素和黃曲霉素等多種化學(xué)致癌物質(zhì)，能保護(hù)人體的貼體組織，增強(qiáng)身體功能。同時鞣花酸可解除草中與大豆的多環(huán)芳香烴，也可抵御熏肉與變霉花生中的致癌物質(zhì)[9]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鞣花酸可導(dǎo)致癌細(xì)胞自體凋亡，卻不影響正常細(xì)胞[10]。

有關(guān)鞣花酸的提取方法有鹽酸法[11]、丙酮法[12]等。本試驗(yàn)以樹莓葉為原料，以乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比為4因素，樹莓中鞣花酸含量為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)，確定樹莓葉中鞣花酸的最佳提取工藝，為樹莓鞣花酸的進(jìn)一步利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

甲醇（色譜純）：美國sigma；95%乙醇、無水乙醇（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；丙酮（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；濃鹽酸（分析純）：廣州德樹化工有限公司；冰乙酸（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；無水碳酸鈉、焦性沒食子酸（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；三氯化鐵、抗壞血酸（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；無水乙酸鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；TPTZ標(biāo)準(zhǔn)品（2，4，6-三吡啶基三嗪，HPLC≥99.0%）：廣東翁江化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑（生化試劑）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98.0%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備

ZKSY-6型一列六孔智能水浴鍋：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHB-IV雙A型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；C9860A型超聲清洗儀：CBL Photoelectron Technology Co Ltd；CK15型高速冷凍離心機(jī)：美國Sigma公司；1100series型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；CARY 50型紫外分光光度儀：美國瓦里安技術(shù)中國有限公司。

1.2方法

1.2.1鞣花酸的測定

1）鞣花酸的提取[13-14]

樹莓葉片→烘干→粉碎→加熱回流→濾膜過濾

取3 g樹莓葉的干粉，過40目篩，加入試劑，回留提取，過濾后，殘?jiān)锰崛∪軇?0 mL洗滌，合并濾液和洗滌液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，即得。

2）色譜條件[15]

C18色譜柱（250 mm×4.5mm，5 μm）；柱溫35℃；流動相為甲醇-水-冰乙酸（50∶49.85∶0.15，體積比），檢測波長為254 nm；進(jìn)樣體積為10 μL；流速1．0 mL/min。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品40 mg，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度均為400μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取對照品溶液2.5、5、10、15、20 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定鞣花酸的峰面積。以鞣花酸含量為橫坐標(biāo)，峰面積為為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=8 745.1x-1 594.4，r=0.999 5。

4）鞣花酸含量計算[16]

式中：U為鞣花酸含量，%；C為提取液中鞣花酸濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2鞣花酸提取的單因素試驗(yàn)

1）乙醇濃度對鞣花酸含量的影響：準(zhǔn)確稱取3 g樹莓干粉，提取料液比3∶100（g/mL），時間為30 min，溫度為80℃，提取一次，采用5個乙醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%）提取鞣花酸。

2）溫度對鞣花酸含量的影響：準(zhǔn)確稱取3 g樹莓干粉，提取料液比3∶100（g/mL），時間為30 min，乙醇濃度80%，提取一次，采用5個溫度（75、80、85、90、95℃）提取鞣花酸。

3）提取時間對鞣花酸含量的影響：準(zhǔn)確稱取3 g樹莓干粉，提取料液比3∶100（g/mL），溫度為95℃，乙醇濃度80%，提取一次，采用5個提取時間（15、30、45、60、75 min）提取鞣花酸。

4）料液比對鞣花酸含量的影響：準(zhǔn)確稱取3 g樹莓干粉，時間為30 min，乙醇濃度80%，溫度為95℃，提取一次，采用5個料液比3∶80、3∶100、3∶120、3∶140、3∶160（g/mL）提取鞣花酸。

1.2.3正交優(yōu)化設(shè)計試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了綜合考慮多因素相互作用對鞣花酸提取率的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交設(shè)計。

1.2.4重現(xiàn)性試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)中選出最佳提取工藝，進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相對平均偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分析，檢測提取方法的重現(xiàn)性。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1乙醇濃度對鞣花酸含量的影響

乙醇濃度對鞣花酸含量的影響見圖1。

圖1　乙醇濃度對鞣花酸含量的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on the content of ellagic acid

乙醇濃度在90%時，鞣花酸含量最大；隨著乙醇濃度的提高，少量鞣花酸在乙醇溶液中的溶解度下降析出，過濾、離心操作時沉淀下來，造成鞣花酸含量有一定量的減少。

2.1.2提取溫度對鞣花酸含量的影響

提取溫度對鞣花酸含量的影響見圖2。

圖2　乙醇濃度對鞣花酸含量的影響Fig.2　Effect of temperature on the content of ellagic acid

提取溫度在95℃時，鞣花酸含量最大；隨著提取濃度的提高，鞣花酸含量呈現(xiàn)下降趨勢。

2.1.3提取時間對鞣花酸含量的影響

提取時間對鞣花酸含量的影響見圖3。

圖3　提取時間對鞣花酸含量的影響Fig.3　Effect of time on the content of ellagic acid

超聲時間在90 min時，鞣花酸的含量最大。

2.1.4料液比對鞣花酸含量的影響

料液比對鞣花酸含量的影響見圖4。

圖4　料液比對多糖含量的影響Fig.4　Effect of solid to liquid rate on the content of ellagic acid

料液比在3∶140（g/mL）時，鞣花酸的含量最大。隨著料液比增大，鞣花酸的含量逐漸下降。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計以乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比為四因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平見表1。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1　正交因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2　The result of orthogonal experimental test

由表2可知，影響鞣花酸提取工藝的主次順序?yàn)橐掖紳舛取崛囟取崛r間→料液比，最佳提取工藝為A1B2C2D2，即乙醇濃度80%，提取時間60 min，提取溫度95℃，料液比3∶140（g/mL），在此組合下，鞣花酸的含量達(dá)到0.4328 mg。

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，按上述色譜條件鞣花酸含量3次，計算測得RSD為1.36%，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3　結(jié)論

本研究表明，影響鞣花酸提取效率的主次因素分別為：乙醇濃度→提取溫度→提取時間→料液比，最佳提取工藝為A1B2C2D2，即乙醇濃度80%，提取時間60 min，提取溫度95℃，料液比3∶140（g/mL），在此組合下，樣品中鞣花酸的含量最高。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.014

收稿日期：2015-04-19

基金項(xiàng)目：北京電子科技職業(yè)學(xué)院重點(diǎn)課題（編號：YZK2013021）

作者簡介：劉卉（1967—），女（漢），副教授，本科，研究方向：食品藥品抗氧化研究。

*通信作者

Study on the Extraction Technology of Ellagic Acid in Raspberry Leaf

LIU Hui，YANG Guo-wei*，LAN Rong，MA Wen-zhi，LIN Feng
（Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China）

Abstract：In order to study the extract technology of ellagic acid from raspberry leaves.The content of ellagic acid was detected by HPLC.Three levels of the factors including ethanol concentration，extraction time，extraction temperature，material-liquid ratio were selected for the design.The orthogonal experiment showed that the order of factors which affected the content of ellagic acid was ethanol concentration＞extraction temperature＞extraction time＞material-liquid ratio.The optimum conditions for the extraction rate were as follows：ethanol concentration 80%，Extraction time 60 min，Extraction temperature 95℃，material-liquid ratio 3∶140（g/mL）.

Key words：raspberry；ellagic acid；extraction technology