利用蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素工藝及產(chǎn)物性能研究

張　雯，葛萬云，齊香君（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安710021）

利用蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素工藝及產(chǎn)物性能研究

張雯，葛萬云，齊香君
（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安710021）

摘要：為提高木醋桿菌（Acetobacter xylinum）發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）的生產(chǎn)效率，采用單因素及正交實驗對纖維素酶水解蘋果渣工藝進行優(yōu)化，同時利用傅里葉紅外光譜（FT-IR）和X-射線衍射（XRD）對發(fā)酵產(chǎn)物BC的性能和結(jié)構(gòu)進行比較。單因素及響應(yīng)面實驗結(jié)果確定蘋果渣最優(yōu)水解工藝：液固比4 mL/g，酶用量16.8 EGU/g，pH5.5，水解溫度55℃，水解時間40 h。此條件下，蘋果渣水解產(chǎn)生還原糖產(chǎn)率為38.02%。蘋果渣水解液發(fā)酵產(chǎn)物BC結(jié)構(gòu)性能與基本培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物BC基本一致。研究結(jié)果表明蘋果渣能夠作為發(fā)酵原料發(fā)酵生產(chǎn)BC，且不影響B(tài)C性能。

關(guān)鍵詞：蘋果渣；細(xì)菌纖維素；纖維素酶；正交試驗

細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose，簡稱BC）是由生長在液態(tài)含糖基質(zhì)中的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的纖維素成分。與植物纖維素相比，BC不含半纖維素和木質(zhì)素，具有高持水率（大于90%）、高分子量以及較高的結(jié)晶度。目前，BC作為一種新型功能材料受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注，已成功地應(yīng)用于食品、生物醫(yī)學(xué)、膜濾器等多個領(lǐng)域[1-2]。目前BC的生產(chǎn)原料大多為椰汁或復(fù)合培養(yǎng)基，主要集中在東南亞等國家。單一的生產(chǎn)原料及地域限制使BC存在生產(chǎn)及運輸成本過高等問題，只能應(yīng)用于高附加值產(chǎn)品的開發(fā)。降低生產(chǎn)成本、擺脫原料地域限制是我國BC產(chǎn)業(yè)面臨的一個重大挑戰(zhàn)[3]。蘋果渣是蘋果汁加工業(yè)的副產(chǎn)物，富含碳水化合物、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[4]。其直接廢棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費和環(huán)境污染。蘋果渣中含有的纖維素，經(jīng)過適當(dāng)處理后，可以轉(zhuǎn)化為小分子糖，另外，它含有的微量礦物質(zhì)也是微生物生長繁殖的理想原料。Joshi V.K. 等[7]將蘋果渣分別接入啤酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、產(chǎn)蛋白酵母等進行固態(tài)發(fā)酵，Sandhu等[8]利用酵母發(fā)酵蘋果渣產(chǎn)生乙醇、粗蛋白和可溶蛋白。本研究擬利用蘋果渣水解液作為原料生產(chǎn)BC，采用單因素及正交試驗對蘋果渣水解工藝進行優(yōu)化。同時研究發(fā)酵產(chǎn)物BC性能，探索蘋果渣作為發(fā)酵原料對BC的影響。本研究可為BC發(fā)酵提供一種廉價原料，為蘋果渣的綜合利用、附加值的提升和果汁的清潔化生產(chǎn)提供一條新的途徑，具有良好的社會效益及經(jīng)濟效益。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種

木醋桿菌（Acetobacter xylinum）；蘋果渣：陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司；纖維素酶（700 EGU/g）：諾維信中國生物技術(shù)有限公司；其余試劑均采用國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.2培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氫二鈉4.40g、檸檬酸0.80g、乙醇10mL、自來水1000mL、pH 6.0；蘋果渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氫二鈉4.40 g、檸檬酸0.80 g、乙醇10 mL、蘋果渣水解液1 000 mL、pH6.0。

1.1.3儀器

D/max2200PC全自動X-射線衍射儀：日本Rigalcu；VERTEX 70傅立葉變換紅外光譜儀：德國Brucher公司；MG250B恒溫培養(yǎng)箱、HYG-1A恒溫振蕩器：上海新瑞儀器有限公司；752型紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1測定分析方法

1.2.1.1還原糖的測定

采用DNS法[9]。

1.2.1.2BC膜處理

將發(fā)酵所得BC膜浸泡于0.10 mol/L NaOH溶液中，80℃浸泡30 min，繼續(xù)加熱煮沸2 h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗，直到pH為7.0，冷凍干燥[9]。

1.2.1.3BC膜產(chǎn)量測

采用稱重法[9]。

1.2.1.4BC鑒定及基團分析

采用傅里葉紅外光譜掃描法[9]（樣品處理：取適量BC干膜放入紅外光譜儀中進行測定，450 mW，掃描范圍4 500 cm-1～400 cm-1，設(shè)定分辨率4 cm-1，掃描速度為0.2 cm/s，室溫下操作）。

1.2.1.5BC膜結(jié)晶度

采用X-射線衍射光譜掃描法[9]（樣品處理：BC干膜平整固定在樣品架上，銅靶，測試電壓40 kV，測試電流100 mA，速率5°/min，步寬0.02°，2θ為0～80°范圍掃描。根據(jù)X衍射參數(shù)，由下面兩個計算公式分別計算細(xì)菌纖維素的結(jié)晶度（Xc）和晶體的粒徑L；

式中：I為衍射峰的衍射強度；Iam為無定形區(qū)衍射強度；β為半峰寬（rad）；k為常數(shù)，通常取0.89；λ為X射線波長（0.154 06 nm）；θ為布拉格衍射角。

1.2.2BC的發(fā)酵

移取木醋桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量30 mL/250 mL三角瓶，接種量20%，30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10 d。

1.2.3纖維素酶水解蘋果渣單因素試驗

1.2.3.1固液比對蘋果渣水解的影響

取經(jīng)粉碎干燥的蘋果渣5.00 g，加自來水至液固比分別為3、4、5、6、7 mL/g，加纖維素酶至終濃度為40.00 EGU/g，pH 5.2～5.5、55℃水解14 h，反應(yīng)結(jié)束后升溫至100℃，維持10 min滅酶，得蘋果渣水解液。以水解液中還原糖的產(chǎn)率為指標(biāo)考察不同固液比對纖維素水解效率的影響。

1.2.3.2酶用量對蘋果渣水解的影響

按照以上試驗優(yōu)化工藝，考察纖維素酶終濃度為6.72、10.08、13.44、16.80、20.16 EGU/g時，對纖維素水解效率的影響。其余工藝同1.2.3.1。

1.2.3.3pH對蘋果渣水解的影響

按照以上試驗優(yōu)化工藝，用ω（NaOH）=3%的溶液調(diào)整pH，考察pH分別為3.5、4.5、5.0、5.5、6.5時，對纖維素水解效率的影響。其余工藝同1.2.3.1。

1.2.3.4溫度對蘋果渣水解的影響

按照以上試驗優(yōu)化工藝，考察水解溫度分別為35、45、50、55、65℃時，對纖維素水解效率的影響。其余工藝同1.2.3.1。

1.2.3.5水解時間對蘋果渣水解的影響

按照以上試驗優(yōu)化工藝，考察水解時間分別為6、12、24、48、72、96、120 h時，對纖維素水解效率的影響。其余工藝同1.2.3.1。

1.2.4纖維素酶水解蘋果渣正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定正交試驗考察因素及水平，確定纖維素酶水解蘋果渣最優(yōu)工藝。

1.2.5發(fā)酵產(chǎn)物性能研究

以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為菌種，按照優(yōu)化工藝制備蘋果渣水解液，配制發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)BC，記為BC-YP，利用基本培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)BC記為BC-DZ。利用傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）及X-射線衍射儀（XRD）對BC-YP及BC-DZ進行檢測，研究蘋果渣水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料對BC性能的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

液固比對蘋果渣水解的影響如圖1所示。

圖1　液固比對蘋果渣水解的影響Fig.1　Effect of liquid-solid ratio on pomace hydrolyzing

由試驗過程可知，液固比不同，蘋果渣形態(tài)也不相同。液固比為3 mL/g時，蘋果渣不能被完全潤濕；液固比為4 mL/g時，蘋果渣充分潤濕，呈松散狀；液固比為5 mL/g時，蘋果渣呈糊狀；液固比大于6 mL/g時，蘋果渣成為懸浮液。由圖1可知，蘋果渣水解過程中，液固比為3 mL/g時，纖維素水解成還原糖的產(chǎn)率較低。隨著液固比的增大，還原糖產(chǎn)率變化顯著提高，當(dāng)液固比達(dá)到4 mL/g以上時，蘋果渣能夠被完全潤濕，繼續(xù)增加液固比對還原糖產(chǎn)率影響不大。考慮到提高水解效率的同時減少水用量，選擇液固比4 mL/g為較佳參數(shù)。

酶用量對蘋果渣水解的影響如圖2所示。

圖2　酶用量對蘋果渣水解的影響Fig.2　Effect of celluclast dosage on pomace hydrolyzing

由圖2可知，隨著纖維素酶用量的升高，還原糖產(chǎn)率也逐漸升高。當(dāng)酶用量達(dá)到16.8 EGu/g以上時，還原糖產(chǎn)率的升高隨酶用量的變化趨于平緩。綜合考慮水解效率和成本因素，選擇酶用量16.8EGU/g為較佳參數(shù)。

pH對蘋果渣水解的影響如圖3所示。

圖3　pH對蘋果渣水解的影響Fig.3　Effect of pH on pomace hydrolyzing

不同pH條件下，纖維素酶表現(xiàn)出不同的酶活性。由圖3可知，水解pH為5.0左右時，纖維素酶具有較高活性，此條件下進行蘋果渣的水解，還原糖產(chǎn)率最高。選擇pH5.0為較佳參數(shù)。

溫度對蘋果渣水解的影響如圖4所示。

圖4　水解溫度對蘋果渣水解的影響Fig.4　Effect of hydrolytic temperature on pomace hydrolyzing

由圖4可知，曲線頂點對應(yīng)的溫度50℃即為纖維素酶水解蘋果渣的最適反應(yīng)溫度，在低于或高于50℃時，纖維素酶的水解能力均有所降低，高溫時更為明顯，可能是過高的溫度引起酶蛋白的變性所致。

水解時間對蘋果渣水解的影響如圖5所示。

水解時間在48 h之內(nèi)時，還原糖產(chǎn)率隨水解時間的延長呈顯著升高趨勢，48 h以后，還原糖產(chǎn)率上升速率減慢，繼續(xù)延長水解時間不能得到更高還原糖產(chǎn)率。選擇水解時間48 h為較佳參數(shù)。

2.2正交試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇酶用量、pH、水解溫度和水解時間四個因素進行正交試驗（表1），確定蘋果渣最優(yōu)水解工藝，正交試驗結(jié)果如表2所示。

圖5　水解時間對蘋果渣水解的影響Fig.5　Effect of hydrolytic time on pomace hydrolyzing

表1　正交試驗設(shè)計Table 1　Design of orthogonal experiments

表2　正交試驗結(jié)果及分析Table 2　Results of orthogonal experiments

取蘋果渣5.00 g，按照正交試驗所確定最佳工藝條件（A2B3C3D1）進行蘋果渣水解，還原糖產(chǎn)率為38.02%，高于正交試驗中各次試驗的還原糖產(chǎn)率，試驗結(jié)果與正交試驗所得結(jié)論一致。

由正交試驗及補充試驗結(jié)果可知，影響蘋果渣水解的因素顯著性順序為：pH＞水解溫度＞酶用量＞水解時間。纖維素酶水解蘋果渣的最優(yōu)工藝為A2B3C3D1：酶用量16.8EGU/g，pH5.5，水解溫度55℃，水解時間40h。2.3發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與性能

以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為菌種，按照優(yōu)化工藝制備蘋果渣水解液，配制蘋果渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基進行BC發(fā)酵。蘋果渣水解液發(fā)酵BC（BC-YP）與基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）紅外圖譜如圖6所示。

圖6　基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）與蘋果渣水解液發(fā)酵BC（BCYP）紅外圖譜Fig.6　FT-IR of BC produced from basic medium（BC-DZ）andBC from pomace hydrolysate（BC-YP）

吸收峰3 285、1 154、1 077、1 040 cm-1證實了樣品中大量-OH的存在；吸收峰2 925、1 383、645 cm-1證實了-CH2-、-CH-和C-H的存在；吸收峰1 241 cm-1證實了環(huán)C-O-C的存在；吸收峰1 241、1 033 cm-1證實了直鏈C-O-C的存在[11-12]。以上結(jié)果顯示為細(xì)菌纖維素葡聚糖的特征吸收，可以推斷出兩種樣品的主要成分均為細(xì)菌纖維素。由圖6可知，BC-YP和BC-DZ紅外圖譜基本一致，說明兩種樣品的化學(xué)組成非常相似，蘋果渣水解液作為發(fā)酵原料不影響B(tài)C的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

蘋果渣水解液發(fā)酵BC（BC-YP）與基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）XRD圖譜如圖7所示。

圖7　基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）與蘋果渣水解液發(fā)酵BC（BCYP）XRD圖譜Fig.7　XRD of BC produced from basic medium（BC-DZ）and BC from pomace hydrolysate（BC-YP）

由圖可知，BC-YP和BC-DZ的X-射線圖譜大致相同，且在相同位置處均含有主要衍射峰，分別在144.8°、16.8°和21.7°附近存在三個衍射峰，此三個峰分別對應(yīng)纖維素晶體的＜101＞、＜101＞和＜002＞晶面[13]，據(jù)此可知BC-YP和BC-DZ為Ⅰ型纖維素。

兩種樣品的結(jié)晶度與晶體粒徑的結(jié)果如表3所示。

表3　基本培養(yǎng)基發(fā)酵BC（BC-DZ）與蘋果渣水解液發(fā)酵BC（BC-YP）XRD結(jié)果Table 3　XRD result of BC produced from basic medium（BC-DZ）and BC from pomace hydrolysate（BC-YP）

結(jié)果表明，BC-YP和BC-DZ的結(jié)晶度基本相同，均為24%左右，BC-YP粒徑大于BC-DZ。結(jié)晶度與纖維的抗張強度、楊氏模量、硬度、伸長率、吸濕性、潤脹度、柔軟性等性質(zhì)有一定的關(guān)系[14]，說明蘋果渣水解液作為發(fā)酵原料不影響B(tài)C結(jié)晶度。晶體粒徑與透明度、撕裂因子有關(guān)，蘋果渣水解液中含有纖維素未水解完全的多糖成分，部分多糖可在BC合成過程中結(jié)合到BC中，從而改變BC的晶體粒徑。

3　結(jié)論

通過單因素和正交試驗對纖維素酶水解蘋果渣工藝進行了優(yōu)化，確定了最優(yōu)水解工藝：液固比4 mL/g，酶用量16.8 EGu/g，pH 5.5，水解溫度55℃，水解時間40 h。在此條件下，蘋果渣水解產(chǎn)生還原糖產(chǎn)率為38.02%。利用該工藝進行蘋果渣水解液的制備，用于BC的發(fā)酵生產(chǎn)，利用FT-IR及XRD對發(fā)酵產(chǎn)物BC化學(xué)基團、結(jié)晶性能進行了比較，結(jié)果表明，蘋果渣水解液發(fā)酵產(chǎn)物BC結(jié)構(gòu)性能與基本培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物BC基本一致。研究結(jié)果表明，蘋果渣能夠作為發(fā)酵原料發(fā)酵生產(chǎn)BC，且不影響B(tài)C性能。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.027

收稿日期：2015-05-19

基金項目：陜西省科技廳自然基金項目（2012JM2005）；陜西省教育廳科研專項項目（15JK1108）；2013年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310708014）

作者簡介：張雯（1982—），女（漢），副教授，博士生，研究方向：生物制藥。

Study of Process for Bacterial Cellulose Fermentation with Pomace and Properties of the Product

ZHANG Wen，GE Wan-yun，QI Xiang-jun
（School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science&Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

Abstract：In order to increase the producing efficiency of bacterial cellulose（BC）fermented by Acetobacter xylinum using pomace，single factor and orthogonal experiments were used to optimize the hydrolysis process of pomace.Meanwhile，the properties of BC were compared through fourier transform infrared（FT-IR）and X-ray diffraction（XRD）.According to the results of experiments，the optimal hydrolysis process were determined as follows：liquid-solid ratio 4 mL/g，dosage of celluclast 16.8 EGU/g，pH5.5，hydrolytic temperature 55℃，hydrolytic time 40 h.Under these conditions，the productive rate of reducing sugar was 38.02%.The properties and structures of BC produced with pomace hydrolysate were confirmed to be basically same with BC produced with basic medium，which indicated that the pomace hydrolysate could be used as part of raw materials to ferment BC and would not affect the properties of BC.

Key words：pomace；bacterial cellulose；celluclast；orthogonal experiments