超高壓條件對鮮切蓮藕殺菌效果的影響

孫兆遠，侯會絨，陳曉東，王麗華（.江蘇食品藥品職業技術學院食品與營養工程學院，江蘇淮安3003；.淮安快鹿牛奶有限公司，江蘇淮安3003）

超高壓條件對鮮切蓮藕殺菌效果的影響

孫兆遠1，侯會絨1，陳曉東2，王麗華2
（1.江蘇食品藥品職業技術學院食品與營養工程學院，江蘇淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江蘇淮安223003）

摘要：以鄂蓮四號蓮藕為試材，采用超高壓技術對鮮切蓮藕進行殺菌，探討了超高壓壓力、保壓時間、加壓溫度、溶液pH等因素對鮮切蓮藕中菌落總數和微生物殘活率的影響。通過單因素和正交試驗確定了超高壓殺菌最優條件為：壓力400MPa、保壓時間25min、加壓溫度50℃、溶液pH 4.5，在此條件下，鮮切蓮藕中的菌落總數為60.3 cfu/g。

關鍵詞：鮮切蓮藕；超高壓；殺菌

鮮切果蔬制品是指新鮮的果蔬經清洗、整修、去皮、切分、護色、包裝等處理，供消費者立即食用或餐飲業使用的一種新式加工產品，因其自然、新鮮、衛生和方便等特點而深受消費者的喜愛[1]。盡管傳統的高溫熱力殺菌方式技術成熟，設備先進，但長時間的高溫加熱，不可避免地對食品的風味、色澤、質構、營養產生較大的負面影響，而鮮切果蔬制品對感官性狀和質構特性的需求，決定了不能采用熱力殺菌技術進行處理。超高壓（Ultra-high pressure processing，UHP）殺菌是指將密封于耐高壓彈性容器內的食品置于以水或其他流體為傳壓介質的壓力系統中，經100MPa～1 000MPa高靜壓力處理，在較低溫度下達到殺菌、滅酶或改善食品功能特性等效果的食品加工方法[2]。不同于一般的熱殺菌方法，超高壓殺菌時壓力僅作用于對生物大分子立體結構有貢獻的次級鍵（如氫鍵、離子鍵、疏水作用等非共價鍵），而對形成蛋白質、淀粉等高分子物質以及維生素、色素和風味物質等低分子物質的共價鍵沒有破壞作用或只有輕微的影響[3-4]。該技術不但能引起食品原料及所含微生物主要酶系的失活，殺死病原微生物，延長食品的貨架期，還能更好地保持食品原有的生物特性、風味及營養成分，非常適合鮮切蓮藕制品的加工與生產。

超高壓對微生物的致死效應不僅與壓力大小、保壓時間、加壓方式、協同溫度、介質性質有關，還受到微生物種類、食品組織狀態和組成成分等因素的影響[5]，為取得較好的殺菌效果，需根據不同的食品對象選擇不同的處理條件。雖然近年來有關超高壓對肉制品、乳制品、果蔬汁制品、水產品殺菌效果和品質影響的研究報道較多，但對鮮切蓮藕殺菌效果影響的研究鮮有報道。為了探索超高壓殺菌技術在蓮藕深加工中的應用，提高蓮藕附加值，本文利用超高壓對鮮切蓮藕進行殺菌處理，以菌落總數和微生物殘活率為指標，探討超高壓壓力、加壓溫度、加壓時間和溶液pH等因素對鮮切蓮藕殺菌效果的影響，并通過正交試驗對殺菌條件進行了優化，旨在推動超高壓技術在鮮切蔬菜中的應用，以期為蓮藕新型加工方法的應用提供理論和技術參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

鄂蓮四號蓮藕（NelumbonuciferaGaertn Elian No. 4）：淮安中天生物工程有限公司提供，10月底采收，置于4℃冷庫中備用；檸檬酸、氯化鈉（分析純）、營養瓊脂培養基（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2試驗儀器

HPP600-3超高壓處理裝置（工作壓力0MPa～600MPa，設備功率3 kW～5 kW，有效容積3 L）：包頭科發高新技術食品機械公司；DS-1電動組織搗碎機：上海精科實業有限公司；BPC-250F智能生化培養箱：上海俊晟生物科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-50KBS全自動高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械有限公司；SJY-1000真空包裝機：成都洛克鑫機電有限公司；PHS-3C酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；JA1003A電子精密天平：上海倫捷機電儀表有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理

挑選藕節均完好，藕身較粗，色澤乳白，無異色，無斑點，無機械傷害的蓮藕，洗凈淤泥，去藕蒂和皮，清水洗凈后切分為4mm～5mm的薄片，與50mL一定pH的浸泡溶液一起裝入聚乙烯塑料袋中（5片/袋，單片平鋪，不疊加），真空包裝后立即進行超高壓滅酶處理。

1.3.2超高壓處理

將1.3.1獲得的蓮藕浸泡于高壓系統傳壓介質油（葵二酸二辛酯液壓油）中，固定升壓速率50MPa/s，卸壓速度100MPa/s，在設定的壓力和溫度下加壓一段時間后取出，置于冰浴中冷藏，并盡快完成各項指標檢測。

1.3.3菌落總數測定

依據GB4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》方法進行檢測。

1.3.4微生物殘活率計算

殺菌效果采用微生物殘活率進行評價[6]，微生物殘活率計算公式如下：

lg S=lg（N/N0）

式中：S為微生物殘活率；N0為超高壓處理前樣品中微生物數量，cfu/g；N為超高壓處理后樣品中微生物數量，cfu/g；lg S為處理前后菌落總數降低的對數值。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1壓力對殺菌效果的影響

取浸泡溶液pH為4.5的鮮切蓮藕，在加壓溫度30℃、保壓時間15min條件下，分別調整設備壓力為100、200、300、400、500、600MPa，按照1.3.2、1.3.3進行殺菌試驗和指標檢測，以菌落總數和微生物殘活率為指標考察超高壓壓力對殺菌效果的影響，試驗結果見圖1。

圖1　壓力大小對微生物殺菌效果的影響Fig.1　Effectofdifferent pressure on them icrobial inactivation of fresh-cut lotus

由圖1可知，雖然在鮮切蓮藕制備過程中進行了嚴格的衛生處理，但未經過加壓處理的鮮切蓮藕初始菌落總數仍然很高（1.5×104cfu/g）。當壓力增加到100MPa時，菌落總數迅速降為6.1×103cfu/g，殘活率僅為未加壓前的40.60%（lg S=-0.391 5）。這主要是因為當超高壓使得食品物料原有的常壓平衡系統破壞后，組成物料的分子和細胞會通過減小相互距離的方式來建立新的平衡系統[7]。在新平衡系統建立過程中，微生物細胞會發生諸如外形變長、細胞壁變厚、胞壁脫離、細胞表面褶皺或分節，磷脂分子橫切面積縮小，細胞膜雙層結構收縮等現象[8]，當壓力過大時會造成細胞膜機械性斷裂，細胞膜結構完全被破壞，胞內核酸和蛋白質滲出細胞，最終導致微生物死亡[9-10]；同時，超高壓使蛋白質高級結構中的氫鍵、離子鍵、疏水鍵體積縮小，甚至被切斷，從而引起其活性中心結構和立體構象的崩潰，造成酶蛋白發生不可逆性變性，進一步造成酶系統的破壞和生物體生命活動的停止[11]；研究還表明，超高壓能使細胞膜上的磷脂由液晶態轉變為晶態，從而導致細胞膜流動性降低，細胞膜通透性增加，致使氨基酸攝取和ATP合成受阻，微生物代謝紊亂，這也加速了細胞的破壞和凋亡[12]；此外，超高壓還能通過改變次級鍵間距的方式對DNA立體結構進行破壞，進一步降低DNA的穩定性，影響微生物DNA復制和轉錄[13]。

隨著壓力的增加，菌落總數先快速下降，并在300 MPa時達到580 cfu/g，殘活率僅為未加壓前的3.87%（lg S=-1.412 7）；當壓力大于400MPa后，菌落總數隨著壓力的增加緩慢下降，并在500MPa時達到商業無菌狀態（小于100 cfu/m L）；但是即使加壓至600MPa，細菌仍然存活（菌落總數=85 cfu/g），且與500MPa壓力下的菌落總數（91 cfu/g）差別很小，差異并不明顯。這主要是因為每種微生物都有特定的耐壓閾值。對壓力敏感的微生物耐壓閾值相對較低，而耐壓菌閾值較高[6]。當實際受壓壓力小于閾值時，微生物細胞雖然發生形變和皺縮，但是不會引起細胞死亡。只有當壓力超過耐壓閾值時，微生物才會出現諸如細胞膜完整性被破壞、細胞內含物泄漏、胞漿蛋白凝固、核酸變性等導致微生物死亡的現象[14]。一般來說，真核生物比原核生物對壓力更敏感，如酵母菌和霉菌耐壓能力遠小于細菌，而細菌中革蘭氏陰性菌的耐壓性小于革蘭氏陽性菌。這主要是因為革蘭氏陰性菌肽聚糖含量較低（5%～20%），肽聚糖層數較少（1層～2層），細胞壁較薄（10 nm～15 nm），在超高壓作用下，易造成細胞壁破裂。而革蘭氏陽性菌肽聚糖含量高（50%～80%），肽聚糖層數較多（可達50層），細胞壁較厚（20 nm～80 nm），網絡結構緊密，受壓時能通過較大幅度的形變來保護細胞壁的完整性[8]。鮮切蓮藕樣品中菌類多而雜，其中主要優勢菌有乳酸菌、腸桿菌、假單胞菌和酵母菌[15]，當壓力逐漸增大時，耐壓閾值低的酵母菌首先被殺死，隨后是對壓力敏感的革蘭氏陰性菌（腸桿菌、假單胞菌），而少量的革蘭氏陽性乳酸菌由于未達到其閾值而存活下來，即使增加保壓時間，也不能將其殺死。

2.1.2保壓時間對殺菌效果的影響

取浸泡溶液pH為 4.5的鮮切蓮藕，在壓力400MPa、加壓溫度30℃條件下，分別調整保壓時間為5、10、15、20、25、30min，按照1.3.2、1.3.3進行殺菌試驗和指標檢測，以菌落總數和微生物殘活率為指標考察保壓時間對殺菌效果的影響，試驗結果見圖2。

圖2　保壓時間對殺菌效果的影響Fig.2　Effectof pressureholding timeon themicrobialinactivation of fresh-cut lotus

由圖2可知，在400MPa的高壓條件下，菌落總數在短短的5min內由未加壓前的1.5×104cfu/g迅速下降為7.6×104cfu/g，殘活率僅為未加壓前的50.81% （lg S=-0.294 1），而10min后菌落總數則迅速降為1.6×103cfu/g，殘活率僅為未加壓前的10.67%（lg S=-0.972 0）。這主要是因為超高壓處理具有作用均勻、處理時間短、不受食品體積和形狀的影響特點[16]。當外部壓力作用于不可壓縮物體上時，物體中所有原子和分子幾乎在同時受到同樣的壓力 [帕斯卡定律（Pascal'slaw）]。浸泡于溶液中的蓮藕就屬于不可壓縮物體，在外力產生壓力增值后，此壓力增值瞬時間無損的傳至所有原子和分子，蓮藕與溶液中的微生物也會在瞬間受到外部壓力的破壞；當保壓時間為15min時，菌落總數快速下降至156 cfu/g，殘活率僅為未加壓前的1.04%（lg S=-1.983 0），殘活率對數降幅達到最大值（1.011 0）；當保壓時間大于15min以后，隨著保壓時間延長，微生物殘活率下降速率明顯減弱，并在20 min時達到商業無菌狀態（小于100 cfu/mL）；但是即使保壓時間延長至30min，細菌仍然存活（菌落總數=65 cfu/g），且與保壓25min的菌落總數（91 cfu/g）差別很小。

2.1.3加壓溫度對殺菌效果的影響

取浸泡溶液pH為4.5的鮮切蓮藕，在壓力400MPa、保壓時間20min條件下，分別調整加壓溫度為10、20、30、40、50、60℃，按照1.3.2、1.3.3進行殺菌試驗和指標檢測，以菌落總數和微生物殘活率為指標考察加壓溫度對殺菌效果的影響，試驗結果見圖3。

圖3　加壓溫度對殺菌效果的影響Fig.3　Effectof tem peratureon them icrobial inactivation of freshcut lotus

由圖3可知，在10℃的低溫條件下，即使在較高壓力下（400MPa）保持20min，菌落總數仍維持在9.54×103cfu/g的較高水平，微生物殘活率為未加壓前的63.61%（lg S=-0.1965），滅菌效果較差；當溫度升高至20℃時，菌落總數下降幅度較大，但殘活率對數僅降低0.325 3，殺菌效果仍不理想；當溫度升高至30℃時，菌落總數快速下降至580 cfu/g，殘活率僅為未加壓前的3.87%（lg S=-1.412 7），殘活率對數降幅達到最大值（0.890 9）；當溫度高于30℃后，菌落總數隨著溫度的增加緩慢下降，并在50℃時達到商業無菌狀態（菌落總數為88 cfu/g）；但試驗發現過高的溫度（60℃）會使得蓮藕表面出現皺縮，硬度增大，脆度變小，影響鮮切蓮藕的品質。

溫度是影響微生物生長代謝最重要的環境因素，低溫或高溫均會增強超高壓對微生物的殺菌效果[11，14]。這主要是因為低溫下易形成冰晶，在微生物因高壓產生收縮時給細胞產生更多的機械傷害。但冰晶在殺死微生物的同時也會造成成品感官品質變化大和營養流失等現象，失去了超高壓殺菌的意義；高壓殺菌時輔助于適當的中溫可以使得壓力作用放大，不但會減少加壓所需的時間和強度，還可以使得殺菌效果大大提高[17]。這主要是因為適當的中溫可以導致微生物細胞膜的結構和流動性發生變化，生物大分子的次級鍵作用減弱，磷脂聚集狀態也發生變化，加速了微生物的致死速率[18]。另外，微生物對溫度具有極強的敏感性，高溫使得微生物體內蛋白質發生變性，與新陳代謝有關的酶類失活，從而影響微生物的生長[8]。

2.1.4溶液pH對殺菌效果的影響

取浸泡溶液pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的鮮切蓮藕各3份，在壓力400MPa、保壓時間20min、加壓溫度40℃條件下按照1.3.2、1.3.3進行殺菌試驗和指標檢測，以菌落總數和微生物殘活率為指標考察溶液pH對殺菌效果的影響，試驗結果見圖4。

圖4　溶液pH對殺菌效果的影響Fig.4　Effect of pH of solution on them icrobial inactivation of fresh-cut lotus

由圖4可知，在壓力400MPa、加壓溫度40℃和保壓時間20min的條件下，6種不同pH的鮮切蓮藕中菌落總數均小于350 cfu/g（微生物殘活率均小于3%），這表明pH在3.0～5.5之間時，均可獲得較好的殺菌效果。其中溶液pH為5.5時，菌落總數最大（349 cfu/g），殘活率為未加壓前的2.33%（lg S=-1.633 3）；當溶液pH降低至4.5時，菌落總數達到商業無菌狀態（菌落總數=98 cfu/g），殘活率為未加壓前的0.65%（lg S=-2.184 9）；當溶液pH低于4.5時，殘活率基本維持在0.5%左右，殘活率降幅均小于0.05。

pH是影響微生物生長代謝的另一個重要環境因素，每種微生物均有各自最適宜的pH生長需求，遠離最適pH時，微生物的生長就會受到抑制甚至是死亡這主要是因為酶、肽或氨基酸等均屬于兩性電解質低pH環境可改變它們的帶電狀態，影響酶分子和催化基團間的解離狀態，弱化酶分子的各次級鍵，破壞酶的空間結構[19]；同時，高濃度的氫離子可引起菌體表面蛋白質和核酸水解，并破壞酶類活性[18]；另外，加壓后會使得微生物的最適pH范圍逐步縮小，這也降低了發生不可逆變性的壓力閾值，使得細菌細胞對低pH更加敏感[8]。因絕大多數微生物的最適生長pH都在5～9之間，而本試驗選擇的pH范圍為4.0～5.0，遠離了絕大多數微生物的最適生長pH，因此殺菌效果較好。

2.2最佳殺菌條件的確定

在單因素試驗的基礎上，選擇超高壓壓力、保壓時間、加壓溫度和溶液pH為考察因素，以菌落總數為指標進行L9（34）正交試驗，分析各因素對超高壓殺菌效果的影響，并確定殺菌最佳工藝條件。因素水平見表1，試驗結果見表2。采用極差法對正交試驗結果進行分析，并以各因素的水平為橫坐標，k值為縱坐標繪制各因素作用的直觀分析圖（見圖5）。

表1　正交試驗因素水平表Table1　Factorsand levelsin orthogonalarray design

表2　正交試驗結果與極差分析Table2　O rthogonal test resultsand rangeanalysis

續表2　正交試驗結果與極差分析Continue table2　Orthogonal test resultsand rangeanalysis

圖5　直觀分析圖Fig.5　In tuitiveanalysisof orthogonal test

由表3可知，RA（63.33）＞RC（58.00）＞RD（55.33）＞RB（16.33），表明四因素對殺菌效果的影響次序為：A＞C＞D＞B，即壓力對殺菌效果的影響最大，加壓溫度次之，保壓時間對殺菌效果的影響最小。由表3中各水平對應的K值和直觀分析圖可以看出，本試驗的最佳組合為A2B3C3D2，即超高壓最佳殺菌工藝條件為：壓力400MPa、保壓時間25min、加壓溫度50℃、溶液pH4.5。

2.3驗證試驗

按正交試驗結果進行3次平行驗證試驗，結果見表4。

表4　驗證試驗結果Table4　Verification testof optimalsterilization process

由表4可知，在設定的殺菌條件下，菌落總數結果均小于單因素和正交試驗結果，且數值相對穩定，因此確定最佳殺菌條件為：壓力大小400MPa、保壓時間25min、加壓溫度50℃、溶液pH 4.5，在此條件下，菌落總數測定結果平均值為60.3 cfu/g。

3　討論

本文利用超高壓技術對鮮切蓮藕進行殺菌處理，以菌落總數和微生物殘活率為評價指標，探討了超高壓壓力、保壓時間、加壓溫度和浸泡溶液pH等因素對鮮切蓮藕殺菌效果的影響。經過試驗研究和分析得出如下結論：

1）未經過加壓處理的鮮切蓮藕初始菌落總數很高。

2）隨著壓力的增加，菌落總數先快速下降后趨于平緩，但即使給予很高的壓力也不能將蓮藕中所有的微生物殺死。

3）超高壓能在5min～10min內迅速殺死絕大部分微生物，但當保壓時間大于15 min以后，菌落總數緩慢降低。

4）在10℃～20℃的低溫條件下，超高壓殺菌效果并不理想；當溫度升高至30℃時，菌落總數快速下降；當溫度高于30℃后，菌落總數隨溫度的增加緩慢下降。

5）試驗所選6種pH均可獲得較好的殺菌效果，當溶液pH降低至4.5時，菌落總數達到商業無菌狀態。

6）在單因素的基礎上，利用正交試驗確定了超高壓最佳殺菌工藝條件為：壓力大小400MPa、保壓時間25min、加壓溫度50℃、浸泡溶液pH 4.5，在此條件下，菌落總數測定結果平均值為60.3 cfu/g。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.005

收稿日期：2015-10-20

基金項目：淮安市2013年度科技支撐計劃（工業）項目（HAG2013048）

作者簡介：孫兆遠（1979—），男（漢），講師，碩士，主要從事天然產物活性成分的提取與應用研究。

Effectsof Ultra-high Pressure Processing on M icrobial Inactivation of Fresh-cut Lotus

SUN Zhao-yuan1，HOU Hui-rong1，CHENXiao-dong2，WANG Li-hua2
（1.Schoolof Food and Nutrition Engineering，Jiangsu Food&PharmaceuticalScience College，Huaian

223003，Jiangsu，China；2.Huaian Kuailu Milk Co.Ltd.，Huaian 223003，Jiangsu，China）

Abstract：The effects of four reaction parameters，including different pressure，pressure holding time，temperature and pH ofsolution on themicrobial inactivation of fresh-cut lotus（Nelumbo nucifera Gaertn Elian No.4）were investigated by single factorexperimentsand orthogonalexperiment.Results showed that the optimal sterilization process for fresh-cut lotus were as follows：400 MPa，25 min，50℃and pH 4.5.Under these conditions，the totalnumberof colonieswas60.3 cfu/g.

Keywords：fresh-cut lotus；ultra-high pressure；sterilization