超聲輔助提取海帶褐藻多糖硫酸酯的工藝研究

戴圣佳，劉振鋒，2，*，呂衛金，張浚偉，陳士國，葉興乾（.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州 0024；2.浙江藍色海洋生物科技有限公司，浙江舟山6000；.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州0058）

超聲輔助提取海帶褐藻多糖硫酸酯的工藝研究

戴圣佳1，劉振鋒1，2，*，呂衛金1，張浚偉1，陳士國3，葉興乾3
（1.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州 310024；2.浙江藍色海洋生物科技有限公司，浙江舟山316000；3.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310058）

摘要：通過單因素試驗和正交試驗對海帶褐藻多糖硫酸酯的超聲輔助提取工藝進行優化。確定最佳工藝條件為超聲功率250W、超聲時間25min、料液比1∶70（g/mL）、溫度60℃，多糖提取率達5.58%，粗多糖中巖藻糖含量20.93%，硫酸酯基含量26.87%，均高于熱水法提取的多糖。熱水提取方法和超聲輔助提取方法所得的多糖均不含蛋白質和核酸，超聲輔助提取的多糖色素更少。

關鍵詞：海帶；褐藻多糖硫酸酯；超聲；正交試驗

褐藻多糖硫酸酯又名褐藻糖膠、巖藻聚糖硫酸酯、巖藻聚糖等，是一類含有相當數量巖藻糖和硫酸基的水溶性雜聚糖。它是由高度支鏈化的α-L-巖藻糖-4-硫酸酯形成的聚合物，還伴有半乳糖、甘露糖、糖醛酸、木糖、氨基己糖等，組成和結構十分復雜，且在不同褐藻中種類及含量差異很大[1]。近年來，研究發現褐藻多糖硫酸酯具有多種生理活性，包括抗凝血、抗氧化、保護神經細胞、調節免疫、降血糖和血脂、保護腎臟、抗腫瘤及抗病毒等[2-5]。

目前，國內外提取海藻多糖主要采用稀堿、稀酸與熱水抽提的方法。這些方法工藝簡單、操作方便、成本低，但是也存在著提取率較低、活性損失大、過濾純化困難等缺點，大大限制了海藻多糖大規模工業化生產。近年來，微波輔助提取、超聲輔助提取與酶解輔助提取等新提取技術的發展[6-8]，使得對海藻多糖的深入研究成為可能。

本試驗主要研究了超聲輔助提取技術對海帶褐藻多糖硫酸酯提取率的影響，通過正交設計法優化提取工藝以獲得相關參數，并對多糖的部分理化性質進行了研究，以期為深度開發海帶資源提供技術參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

海帶：購于杭州世紀聯華超市。將海帶洗凈曬干粉碎后過60目篩，獲得海帶干粉，置干燥器中以備后續處理。

L-巖藻糖（Sigma）；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、明膠、氯化鋇、硫酸鉀、三氯乙酸、無水乙醇、L-半胱氨酸鹽酸鹽、95%乙醇、濃鹽酸等均為分析純。

1.2儀器與設備

JY88-II超聲波細胞粉碎機：寧波新芝科器研究所；HH2型數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；RE-52型旋轉蒸發儀：上海嘉鵬科技有限公司；紫外可見分光光度計UV-2550：日本SHIMADZU公司；FD1.0-60型冷凍干燥機：丹麥Heto公司；臺式冷凍高速離心機：美國Thermo Scientific公司。

1.3方法

1.3.1樣品制備

參考劉旭等[9]的方法并稍作修改。取海帶干粉4g，在不同條件下超聲輔助提取，離心后取上清液抽濾，濾液濃縮，加95%乙醇至其體積分數為30%，靜置1 h，離心去除褐藻膠，上清液加入95%乙醇至其體積分數為70%，離心收集沉淀并用無水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥即得褐藻多糖硫酸酯粗品。

1.3.2多糖含量的測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[10]。以葡萄糖為標準單糖制作標準曲線。在490 nm處測定吸光度，以糖質量濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，得到回歸方程為Y＝0.043 3X+0.006，R2＝0.996 2。多糖提取率按下式計算。

式中：X為在Y吸光度下根據回歸方程計算所得的值；ρ為校正系數，以葡萄糖作標準曲線，ρ=0.9。

1.3.3巖藻糖含量的測定

巖藻糖含量的測定采用半胱氨酸鹽酸鹽法[11]。以L-巖藻糖為標準糖繪制標準曲線，得到回歸方程為Y＝0.001 8X+0.001 6，R2＝0.997 2，通過標準曲線方程計算其巖藻糖含量。

1.3.4硫酸酯基含量的測定

硫酸酯基含量的測定采用明膠-氯化鋇法[10]。以標準的硫酸酯基溶液做標準曲線，得到的回歸方程為Y＝12.769X＋0.031 4（R2＝0.992 7），其中以硫酸酯基質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標。

樣品含量測定：取一定量樣品，加1mol/LHCl配成1.5mg/mL的溶液，在100℃水浴鍋中水解2 h，取出冷卻至室溫，取0.6m L按標準品方法測其吸光度，通過標準曲線方程計算其硫酸酯基含量。

1.3.5單因素試驗

以超聲功率、料液比、時間和溫度為4個單因素，按表1進行試驗。

表1　褐藻多糖硫酸酯提取的單因素試驗Table 1　Single factor test for theextraction of fucoidan

1.3.6正交試驗

整合單因素試驗的結果，用正交試驗進行條件優化。以多糖提取率、粗多糖中巖藻糖含量、硫酸酯基含量為指標，采用L9（34）正交試驗對海帶干粉多糖進行超聲輔助提取試驗。

1.3.7蛋白質與核酸的檢驗

取多糖樣品溶液在紫外分光光度計上掃描200nm～400 nm波長范圍內的吸收曲線。觀察多糖樣品的吸收曲線在280 nm和260 nm波長條件下有無吸收峰，確定樣品中是否含有蛋白質或核酸。

1.3.8超聲波輔助提取法與熱水提取法[12]的比較

取一定量的海帶干粉，按1.3.6節優化后的提取條件和熱水法分別提取，所得粗多糖按1.3.2節、1.3.3節和1.3.4節的方法，分別測定多糖含量、巖藻糖含量和硫酸酯基含量，并對各種指標進行比較。

1.3.9數據處理

采用Origin 8.0制圖，采用SPSS 18.0對數據進行方差分析、顯著性檢驗，顯著性水平設置為P＜0.05，圖中不同字母（a、b、c）表示不同水平間存在顯著差異。

2　結果與分析

2.1超聲輔助提取多糖的單因素試驗

2.1.1料液比對多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響試驗結果見圖1。

圖1　料液比對多糖提取率的影響Fig.1　Effect of solid/liquid ratio on theextraction of fucoidan

從圖1可以看出，超聲輔助提取多糖的提取率隨著料液比增加而不斷提高，從最初料液比為1∶30（g/mL）時的4.84%上升到最后料液比為1∶80（g/mL）時的5.20%。這可能是由于超聲波能有效地將細胞壁破碎，溶出有效成分，然而同時也溶出了大量的黏性液質，不利于傳質擴散[13]，而增大料液比，提高溶劑的比例，可以有效地降低提取液的黏度，從而有利于多糖的提取。但在實際操作過程中，溶液體積過大不利于后續的濃縮和醇沉實驗，同時也會增加生產成本，因此根據試驗條件選取合適的料液比，設定正交表中料液比的3個水平為1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）。

2.1.2超聲功率對多糖提取率的影響

超聲功率對多糖提取率的影響試驗結果見圖2。

圖2　超聲功率對多糖提取率的影響Fig.2　Effectof ultrasonic power on the extraction of fucoidan

從圖2可以看出，超聲功率對多糖提取率有顯著的影響。超聲輔助提取技術利用超聲波具有的強烈震動、強烈空化效應以及高速攪拌作用，使植物細胞內的有效物質快速進入溶劑[14]，而超聲功率決定了超聲波與介質相互作用的程度，從而影響有效成分的提取率。結果所示，多糖提取率從超聲功率為100W時的4.24%迅速增加，并在超聲功率為250W時達到最大的5.16%，提高21.7%，之后呈下降趨勢。這可能是由于超聲作用進一步增強，使提取液流動加速，從而物料停留在超聲場中的時間減少，破壁作用減弱，多糖溶出速率減緩；另一個原因可能是超聲功率過大會引起部分多糖的降解。故根據試驗條件，設定正交表中超聲功率的3個水平為200、250、300W。

2.1.3超聲時間對多糖提取率的影響

超聲時間對多糖提取率的影響試驗結果見圖3。

圖3　超聲時間對多糖提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic tim eon theextraction of fucoidan

從圖3可以看出，多糖提取率和超聲時間之間緊密相關。超聲5min時，提取率為4.31%，之后隨著超聲時間延長而顯著上升，在超聲25min時達到最大為5.04%，提高16.94%，隨后有所下降。由于褐藻多糖硫酸酯主要存在于細胞間和細胞壁中，超聲能在短時間內破碎細胞，使其釋放出來。當超聲處理時間太短時，還不足以破碎細胞釋放多糖；而時間太長，超聲波的機械剪切作用會使多糖降解，破壞多糖結構[15]，同時還會導致細胞內大量不溶物及黏液質等溶出，從而增大了傳質阻力，影響了有效成分的提取。故根據試驗條件，設定正交表中超聲時間的3個水平為20、25、30min。2.1.4溫度對多糖提取率的影響

溫度對多糖提取率的影響試驗結果見圖4。

圖4　溫度對多糖提取率的影響Fig.4　Effectof tem peratureon the extraction of fucoidan

溫度是影響多糖提取率的重要因素之一，溫度過低，不利于有效成分的溶出；溫度過高則可能會使多糖發生降解或者失去活性。溫度對多糖提取率的影響變化趨勢如圖4所示。從圖中可以看出，多糖提取率隨著溫度的上升而不斷提高。當溫度為20℃～50℃時，多糖提取率上升速度較快，從4.61%提高至5.16%，之后在溫度為50℃～70℃時，多糖提取率保持緩慢增加。為保證較高的多糖提取率，同時避免因溫度過高而引起多糖失活或發生降解，設定正交表中提取溫度的3個水平為50、60、70℃。

2.2超聲輔助提取多糖的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選定超聲功率、超聲時間、料液比、溫度4因素進行正交試驗，因素水平設計見表2。褐藻多糖硫酸酯的化學組成以L-巖藻糖和硫酸酯基為主，且其生物活性與硫酸酯基的含量呈正相關[13]，因此，選擇以多糖提取率、巖藻糖含量和硫酸酯基含量作為優化指標。試驗結果見表3。

表2　正交試驗因素及水平設計Table2　Factorsand levelsin orthogonalarray design

表3　超聲輔助提取褐藻多糖硫酸酯正交試驗結果Table3 O r thogonalarray designmatrix and cor responding results

由表3極差分析結果可以看出，以多糖提取率為指標的因素影響程度依次為：A、B、D、C，即超聲功率＞超聲時間＞溫度＞料液比，最佳組合為：A2B2C3D2；以粗多糖中巖藻糖含量為指標的因素影響程度依次為：A＞B＞C＞D，即超聲功率＞超聲時間＞料液比＞溫度，最佳組合為：A2B1C2D3；以硫酸酯基含量為指標的因素影響程度依次為：A＞D＞C＞B，即超聲功率＞溫度＞料液比＞超聲時間，最佳組合為：A2B2C2D2。

3個指標單獨分析出來的最佳組合條件并不一致，所以需要根據因素對3個指標的影響程度綜合考慮，確定最優工藝條件。超聲功率對3個指標的影響都是第一位，且都是A2，因此超聲功率就選擇250W；超聲時間對指標的影響有兩個第二位，所以考慮B1和B2，但取B2可以獲得更高的多糖提取率和硫酸酯基含量，所以超聲時間選擇25min；料液比對指標的影響有兩個第三位，且都是C2，故料液比選擇1∶70（g/mL）；溫度對硫酸酯基含量的影響排第二位，對多糖提取率的影響排第三位，并且都是取D2較好，所以溫度選擇60℃。經過綜合分析可知，本試驗的最優條件為A2B2C2D2，即超聲功率250W、超聲時間25min、料液比1∶70（g/mL）、溫度60℃。

2.3超聲輔助提取法與熱水提取法的比較

根據正交試驗所得的超聲輔助提取最優工藝條件與熱水法提取褐藻多糖硫酸酯的對比結果見表4。

表4　超聲輔助提取法和熱水提取法的比較Table 4　Com parison between thism ethod and hotwater extractionmethod

由表4可知，超聲輔助法的多糖提取率為5.58%，與劉群等[16]測得的結果（5.641%）非常接近，與高溫長時間的熱水提取相當，而明顯優于相同時間下熱水法的多糖提取率。超聲輔助提取的巖藻糖含量為20.93%，與尤瑜敏等[17]測得的結果（19.56%）相近，而硫酸酯基含量為26.87%，高于王健等[18]測得的21.49%，但低于劉旭等[19]測得的37.14%。但是，兩者均顯著高于熱水法提取，尤其是高溫長時間提取獲得的粗多糖中硫酸酯基含量最低，這可能是由于較高的溫度會在一定程度上破壞多糖分子結構，降低其硫酸酯基含量。

結果表明，超聲輔助提取工藝所需時間短、溫度較低，能夠增加多糖提取率并保持其生物活性，另外，兩種方法提取的多糖均不含蛋白質或核酸。超聲輔助提取獲得的多糖產品顏色也較淺，說明超聲輔助提取法能有效減少色素的析出，有利于簡化除色素等預處理步驟。可以看出，超聲波輔助提取法是一種良好的多糖提取新工藝。

3　結論

通過單因素試驗，初步考察了超聲輔助提取海帶褐藻多糖硫酸酯工藝中超聲功率、超聲時間、料液比、溫度對多糖提取率的影響，確定了正交試驗方案并進行條件優化。經極差分析，多重比較，得出海帶褐藻多糖硫酸酯的最佳提取條件為：超聲功率250W、超聲時間25min、料液比1∶70（g/mL）、溫度60℃。在此工藝條件下獲得多糖樣品，多糖提取率為5.58%，粗多糖中巖藻糖含量為20.93%，硫酸酯基含量為26.87%，均顯著高于熱水法提取。超聲輔助提取工藝能夠增加多糖提取率并保持其生物活性，還能減少色素、蛋白質等其他物質的溶出，有利于后續的分離純化過程，為海帶的高價值化應用提供了理論參考。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.007

收稿日期：2014-04-22

基金項目：杭州市“雛鷹計劃”（20131131k132）；杭州市科研攻關專項（20140432B72）；國家自然科學基金（31301417）

作者簡介：戴圣佳（1984—），男（漢），本科，研究方向：海洋生物資源開發與利用。

*通信作者：劉振鋒（1980—），男（漢），高級工程師，博士，研究方向：海洋生物資源開發與利用。

Ultrasonic-assisted Extraction of Fucoidan from Laminaria japonica

DAISheng-jia1，LIU Zhen-feng1，2，*，LüWei-jin1，ZHANG Jun-wei1，CHENShi-guo3，YEXing-qian3
（1.Zhejiang Yuxiang Biotech Co.Ltd.，Hangzhou 310024，Zhejiang，China；2.Zhejiang Bluemarine Biotech Co.Ltd.，Zhoushan 316000，Zhejiang，China；3.Schoolof BiosystemsEngineeringand Food Science，ZhejiangUniversity，Hangzhou 310058，Zhejiang，China）

Abstract：One-factor-at-a-time and orthogonalarraymethodswere used to investigate the optimalultrasonicassisted extraction processof fucoidan from Laminaria japonica in thiswork.The optimum extraction conditions wereultrasonic treatmentpowerof250W，ultrasonic treatmenttimeof25min，material/liquid ratioof1∶70（g/mL）and extraction temperature of60℃.Under thisoptimum condition the extraction rate，the contentsof fucose and sulfate group were 5.58%，20.93%and 26.87%，respectively，higher than obtained by hotwater extraction. Neither protein nornucleic acid was found in fucoidan obtained using hotwaterextraction or ultrosonic-assisted extraction method，and less pigment was found in fucoidan obtained using ultrosonic-assisted extraction method.

Keywords：Laminaria japonica；fucoidan；ultrasonic；orthogonalarray design