釀酒酵母SH 003生物轉化2-苯乙醇條件的優化

黃筱萍，黃國昌，劉蘭，熊大維，張婷（江西省科學院微生物研究所，江西南昌330029）

釀酒酵母SH 003生物轉化2-苯乙醇條件的優化

黃筱萍，黃國昌，劉蘭，熊大維，張婷
（江西省科學院微生物研究所，江西南昌330029）

摘要：以L-苯丙氨酸為底物，利用釀酒酵母轉化合成2-苯乙醇，對影響釀酒細胞轉化的因素進行考察。確定酵母菌轉化的菌齡，通過單因素和正交試驗，優化轉化培養基組成和培養條件。優化后的培養基組成：葡萄糖120 g/L，酵母粉5 g/L，L-苯丙氨酸8 g/L，MgSO40.2 g/L，KH2PO40.05mol/L，K2HPO40.05mol/L，28℃200 r/min培養轉化24 h，2-苯乙醇產率達4.37g/L，比優化前提高30.1%。

關鍵詞：2-苯乙醇；釀酒酵母；優化；生物轉化

β-苯乙醇（β-phenylethanol，2-PE）亦稱2-苯乙醇，具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣而廣泛用于各種食用香精和煙用香精中。目前主要是通過有機合成或從天然物中萃取獲得該產品。隨著食品生物技術的飛速發展和人們越來越重視食品的安全性，追求有機食品、生態食品、綠色食品已成為一種時尚，國內外食品生產研發人員也越來越傾向于使用天然食品添加劑[1]。天然2-苯乙醇是通過玫瑰精油中提取獲得，受到植物原料等因素影響，無法進行大規模工業生產，且價格昂貴[2]。由此，通過微生物發酵法生產天然苯乙醇香料的工藝研究得到國內外業內人士的廣泛關注與重視。多種酵母具有合成2-苯乙醇的能力，如馬克斯克魯維酵母[3]、發酵畢赤酵母[4]、乳酸克魯維酵母、釀酒酵母及異常漢遜酵母等[5]，主要通過艾氏途徑（Ehrlich pathway）合成2-苯乙醇，但通常產率較低，主要是嚴重的產物抑制成為酵母合成轉化2-苯乙醇的瓶頸。EtschmannM[6]和崔志峰[7]分別報道了在優化的條件下單相分批發酵酵母菌株產2-苯乙醇達3.8 g/L和3.6 g/L，榮紹峰[8]篩選出一株釀酒酵母菌種，在優化的條件下2-苯乙醇含量達3.2 g/L，汪琨[9]等用5 L發酵罐小試生產2-苯乙醇，產量最高達4.1 g/L，梅建風[10]通過正交和響應面優化試驗，在最優的培養條件下，2-苯乙醇產量達4.8 g/L，是至今搖瓶單批發酵產率最高的報道。因此篩選對2-苯乙醇耐受性好、轉化率高的菌株成為國內外持續研究開發的關鍵。前期工作中，本實驗室從葡萄園土壤中篩選獲得一株對2-苯乙醇耐受性較高的菌株SH003，具有較好的生物轉化合成2-苯乙醇能力，并鑒定為釀酒酵母。本試驗通過單因子、正交試驗，進一步優化轉化條件，探討各因素的影響水平，得到較優的培養基組成和轉化條件。動相為甲醇∶水=1∶1（mL/mL），流速為1.0mL/min，檢測波長260 nm，柱溫30℃，進樣量10μL。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種

釀酒酵母SH003：由江西省科學院微生物研究室分離鑒定。

1.1.2培養基

斜面及保藏培養基：麥芽汁瓊脂培養基。

種子培養基（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母粉3，麥芽汁3。

基礎轉化培養基（g/L）：葡萄糖100，酵母粉3，L-苯丙氨酸10，KH2PO45，MgSO40.2。

1.1.3主要試劑

L-苯丙氨酸：河北冀海生物科技有限公司，純度99.5%；2-苯乙醇標準品：Sigma公司，純度98.5%；甲醇：色譜純；超純水：自制；其他試劑均為國產分析純。1.2主要設備

LC-20A高效液相色譜儀、1250紫外分光光度計：日本島津公司；HC-C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）：美國Agilent公司；Prachtum 224-1CN分析天平：德國Sartorius公司。

1.3方法

1.3.1種子液制備

從斜面挑取1～2環菌苔至30 m L種子液中，于28℃、180 r/min培養24 h。

1.3.2轉化培養

種子液按10%的接種量接種于含有L-苯丙氨酸轉化培養液中，于28℃200 r/min培養24 h，轉化液于10 000 r/min離心10min，上清液采用高效液相色譜法檢測發酵液中的L-苯丙氨酸和2-苯乙醇含量。

1.3.3酵母細胞生物量的測定

菌體細胞OD600與菌體干重（DCW）的關系：轉化液用純水稀釋15、20、25、30、40倍，以同樣稀釋度的未接種培養基為空白，用分光光度計測定波長600 nm處的OD值。取同樣稀釋度的轉化液50m L于已稱重量的離心管中，于8 000 r/min離心10min，用純水洗2次，于100℃烘干至恒重，測菌體干重。獲得菌體干重與OD600之間的線性曲線，通過測定菌體OD600計算菌體干重。

1.3.4反相高效液相色譜法測定L-苯丙氨酸和2-苯乙醇含量

發酵液經10 000 r/min離心10min，取上清液，稀釋，用0.22μm聚醚水性濾膜過濾。于HPLC分析。流

2　結果與討論

2.1酵母菌體干重與OD600的關系

按方法1.3.3，得圖1，為酵母菌菌體干重與OD600間的關系曲線，呈良好的線性關系，可通過測定菌液的OD600獲得菌體干重。2.2釀酒酵母SH003生長曲線和種齡對轉化合成2-苯乙醇的影響

圖1　酵母細胞OD600與菌體干重的關系曲線Fig.1　The relationship curve between ofOD600and dry cellweight （DCW）

釀酒酵母SH003接種種子培養液中，于28℃200 r/min搖瓶培養，每2 h取樣，樣品稀釋放20倍，于紫外分光光度計測定OD600值，同時接種基礎轉化培養基中，于28℃200 r/min搖瓶培養24 h，測定2-苯乙醇產量，結果見圖2。

圖2　SH 003種子生長曲線和種齡對轉化合成2-PE的影響Fig.2　Thegrow th curveofseed SH003 and theeffectofseed culturing tim eon 2-PE production

由圖2可知，菌種培養6 h后，進入對數生長期，培養22 h，菌體干重增速減緩，為穩定期，26 h菌體干重最高，達5.58 g/L，繼續培養則略有下降。從菌齡8 h開始接種進行轉化2-苯乙醇，隨著種齡的增長，生物合成轉化2-苯乙醇產量增加，種齡在20 h～28 h 時2-苯乙醇產量相差不大，達2.9 g/L～3.0 g/L，但繼續增加種齡，則合成2-苯乙醇產量明顯下降，這可能是處于衰亡期菌體細胞自溶和轉化酶活力下降有關，因此以下試驗均采用培養24 h的菌體細胞作為轉化種子液。

2.3碳源種類對生物轉化2-苯乙醇的影響

根據釀酒酵母可同化碳源試驗，選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘油、玉米淀粉為碳源，濃度均為80 g/L，L-苯丙氨酸為8 g/L，其余成分均相同，結果見表1。

表1　不同碳源對轉化合成2-苯乙醇的影響Table 1　Effectsof carbon sources concentrate on 2-PE production by bioconversion

表1結果表明，SH003能較好地利用蔗糖和葡萄糖作為碳源轉化成2-苯乙醇，亦能利用麥芽糖，但以玉米淀粉、甘油和半乳糖為碳源轉化產物濃度很低，因此以后的試驗選用蔗糖或葡萄糖為碳源。

2.4糖濃度對轉化2-苯乙醇的影響

在以葡萄糖為碳源的基礎上，考察了不同糖濃度對轉化2-苯乙醇的影響，糖濃度范圍在20 g/L～200 g/L之間，L-苯丙氨酸為8 h/L，結果見圖3。

圖3　葡萄糖濃度對2-苯乙醇合成的影響Fig.3　Theeffect ofglucose concentration on 2-PE bioconversion

從圖3中可以看出，在葡萄糖濃度為20g/L～100g/L時。隨著葡萄糖濃度的增加，2-苯乙醇產量逐漸增加，當糖濃度大于100 g/L時，2-苯乙醇產量增加不明顯，當糖濃度大于140 g/L時，2-苯乙醇產量略有下降。在低糖濃度時，菌體干重隨著糖濃度的增加而增加，當糖濃度大于80 g/L時，菌體干重保持較平穩的狀態，這表明菌株SH003對高濃度的葡萄糖耐受性較強。

2.5氮源對轉化2-苯乙醇的影響

酵母菌能利用無機氮和有機氮，在培養基中添加底物L-苯丙氨酸8 g/L，考察不添加氮源和分別添加3種常用的氮源對酵母菌轉化合成2-苯乙醇的影響。表2為搖瓶培養24 h的結果。

表2　不同氮源對生物轉化2-苯乙醇的影響Table 2　Theeffect of differentnitrogen sourceson 2-PE production

表2表明，在未添加其它氮源僅以底物L-苯丙氨酸為唯一氮源的條件下，2-苯乙醇產量僅次于添加了酵母粉的產量，但菌體干重略低于添加了其它氮源菌體干重。當培養基中添加了無機氮源硫酸銨后，雖然其菌體得率最高，但2-苯乙醇產量非常低，僅為0.25 g/L，可能是由于大量NH4+離子存在，菌體不利用L-苯丙氨酸轉氨反應釋放的NH3，導致艾氏代謝途徑不能順利進行。添加蛋白胨為N源亦未能提高2-苯乙醇的產量，而添加酵母粉可明顯提高2-苯乙醇的產量，因此選用酵母粉作為輔助氮源。

圖4　酵母浸出粉濃度對生物轉化2-PE的影響Fig.4　The Effectofyeastextraction concentration on 2-PE bioconversion

分別在轉化培養基中添加0、1、3、5、7、9 g/L的酵母粉，在相同的轉化條件下分別測定2-苯乙醇的產量，結果見圖4。由圖4可知，隨著轉化培養液中酵母粉濃度的增加，2-苯乙醇產物的濃度亦有所增加，當酵母粉濃度達到5 g/L時，產物濃度最高，為3.4 g/L，而隨著添加酵母粉濃度的繼續升高，產物2-苯乙醇濃度反而開始下降，但菌體干重則隨著酵母粉的濃度增加而明顯增加，這表明添加適量的酵母粉有利于菌體轉化合成2-苯乙醇，而過量酵母粉只有利于菌體的生長。

2.6磷酸鹽及pH對酵母菌轉化合成2-苯乙醇的影響

磷是染色體和高能磷酸化合物的主要組成物質，是細胞代謝必不可缺的元素之一。采用磷酸鹽類緩沖液調節培養基初始pH和控制代謝過程中的pH以及加入CaCO3控制轉化過程的pH，考察pH對產物生成的影響，圖5為在基礎轉化培養基中加入不同濃度的CaCO3（滅菌后加入），對SH003菌株生物轉化2-PE的作用。

圖5　CaCO3對轉化液pH和2-PE產量的影響Fig.5　Theeffect of CaCO3on pH and 2-PE bioconversion

由圖5可以看出，加入CaCO3調節轉化液中的pH，最高產量可達3.92 g/L，較不控制pH的對照提高15.3%，轉化結束終止pH亦較高，為5.2～5.3，而未加入CaCO3的對照轉化液終止pH為3.97，因此在轉化過程中控制轉化液的pH為5.2左右有利于轉化的順利進行。細胞生物量沒有較大的波動，這表明轉化液中的pH對菌體生長影響不大。以上結果表明，在轉化液中添加2 g/L的CaCO3有利于產物的合成。

由于CaCO3難溶于水，過量的CaCO3對用樹脂原位吸附2-PE和后續的提取工藝造成不利的影響，因此采用磷酸鹽緩沖液控制轉化液中的pH，圖6為不同摩爾濃度的pH6.8磷酸鉀緩沖液對生物合成轉化2-PE的影響。

圖6　磷酸鉀緩沖液濃度對轉化液pH和2-PE產量的影響Fig.6　Theeffectof potassium phosphate buffer solution（pH6.8）on pH and 2-PE production

由圖6可以看出，隨著磷酸鹽緩沖液（pH6.8）摩爾濃度的增加，2-PE產量明顯培加，當磷酸鉀緩沖液為0.025mol/L時，產量為3.8 g/L，之后隨著濃度的增加，產量增加明顯減緩，當磷酸鉀緩沖液濃度達0.075mol/L時，2-PE產量達3.98 g/L，增加36.2%，轉化液終止pH 為5.6，生物量亦明顯增加，這表明添加適量的磷酸鉀緩沖液可較好地控制轉化過程中的pH，有利于細胞生長和產物合成。

2.7無機鹽對酵母菌SH003生物轉化2-苯乙醇的作用

細胞生長繁殖和產物代謝過程中均需要無機鹽和微量元素，考察了在不同濃度的NaCl、MgSO4·7H2O、ZnSO4對合成2-苯乙醇的影響。MgSO4·7H2O對2-苯乙醇的合成有明顯的促進作用，當MgSO4·7H2O濃度達0.6 g/L時2-苯乙醇產率最高，達3.88 g/L，低濃度的ZnSO4對2-苯乙醇的合成無明顯影響，隨著濃度升高有輕微的抑制作用，而NaCl對2-苯乙醇的合成無影響。因此在培養基中可不添加ZnSO4和NaCl。

2.8培養基主要組分的正交試驗

通過單因素優化試驗初步確定了影響酵母菌SH003生物轉化2-苯乙醇的主要影響因子為酵母粉、葡萄糖、磷酸鉀和MgSO4·7H2O，由于單因素試驗不能綜合反應各因素、水平間的交互作用，因此在單因素試驗結果的基礎上，即0.75mol/L磷酸鹽和0.6 g/L MgSO4·7H2O的條件下，采用L9（34）正交試驗對培養基主要組分L-苯丙氨酸、葡萄糖和酵母粉進行優化，試驗設計和結果分析見表3和表4。

表3　L9（34）正交試驗設計及結果分析Table3　L9（34）orthogonaldesign and statisticalanalysis

表4　正交試驗方差分析表Table4　Analysisof variance for orthogonal test

正交試驗試驗結果表明，在優化的單因子磷酸鹽和MgSO4·7H2O基礎上設計的正交試驗，2-PE產量均有較大的提高，而最佳培養基組成為葡萄糖120 g/L，酵母粉5 g/L，L-苯丙氨8 g/L。葡萄糖濃度對酵母細胞SH003合成轉化2-苯乙醇具有顯著影響，而酵母粉和L-苯丙氨酸對生物合成2-苯乙醇無顯著影響。

從表3中正交試驗結果K值表明，底物L-苯丙氨酸濃度越高，2-苯乙醇產量越高，為驗證底物濃度對轉化合成2-PE的影響，在優化的條件下，即葡萄糖120 g/L，酵母5 g/L，添加不同濃度底物進行了試驗，結果見表5。

表5　不同碳源對轉化合成2-苯乙醇的影響Table 5　Effectsof L-pheny lalan ine concentrateon 2-PE production by bioconversion

結果表明，隨著底物濃度提高，2-PE產量略有增加，但轉化率急劇下降，當2-PE產量達4.4 g/L時，已達到細胞轉化合成產物的極限值，再提高底物濃度也不會增加產量，綜合考慮產量和底物轉化率，我們認為底物濃度添加量在8 g/L比較適宜。

2.9溫度對轉化合成2-苯乙醇的影響

在上述優化的培養基培養基組成條件下，分別進行了在20、25、28、30、32、35、38℃轉化試驗，不同的轉化溫度下對生物轉化2-苯乙醇有顯著的影響，細胞在28℃～32℃轉化產物濃度較高，而低于26℃和高于32℃產物濃度明顯下降，這可能是在低溫條件下菌體生長較緩慢，酶活在低溫條件下活性降低，而過高的溫度也可導致一些酶失活和菌體快速衰老而影響產物合成，因此最適的轉化溫度為28℃～30℃。

2.10溶氧對轉化合成2-苯乙醇的影響

在搖瓶轉速為200 r/min的條件下，考察了250mL三角瓶中培養基裝量分別為25、50、75、100、125mL時對合成轉化2-苯乙醇產量的影響，酵母菌在生長和轉化過程中需要大量的氧進行菌體繁殖和產物代謝，當搖瓶中培養液裝量較多時，氧的供應量不足而導致2-苯乙醇的產量有下降趨勢。精確的溶氧調控參數需在小型發酵罐中獲得。

3　小結

本試驗通過釀酒酵母SH003菌株種子液生長曲線及種齡對轉化合成2-苯乙醇的影響，確定了最適種齡為20 h～24 h。通過單因素試驗對轉化培養基進行優化，確定了對合成轉化2-苯乙醇影響較大的因素和轉化培養基組成，合適的轉化碳源為葡萄糖和蔗糖，氮源為酵母粉，組成培養基合適的磷酸鉀緩沖液pH為6.8，在培養基中添加MgSO4和CaCO3有利于細胞合成2-苯乙醇。在單因素的基礎上，通過正交試驗進一步對葡萄糖、酵母粉和L-苯丙氨酸濃度進行優化，優化后的培養基配方為：葡萄糖120 g/L，酵母粉5 g/L，L-苯丙氨酸8 g/L，MgSO40.2 g/L，KH2PO46.8 g/L，K2HPO48.7 g/L。優化后生物合成2-苯乙醇產量最高達4.37 g/L，比優化前產量提高了30.1%。最適轉化溫度為28℃～30℃，在轉速200 r/min時，裝液量為50mL/250mL三角瓶。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.040

收稿日期：2014-11-05

基金項目：江西省科技支撐項目（20133BBE50018）

作者簡介：黃筱萍（1965—），女（漢），研究員，碩士，主要從事生物發酵、活性物質提取精制的研究。

The Optim ization of Bioconversion Conditions for the Production of 2-phenylethanolw ith Saccharomyces cerevisiae SH003

HUANGXiao-ping，HUANGGuo-chang，LIULan，XIONGDa-wei，ZHANGTing
（Institution ofMicrobiology，JiangxiAcademyof Sciences，Nanchang 330029，Jiangxi，China）

Abstract：The bioconversion conditions for the production of 2-phenylethanolwith Saccharomyces cerevisiae SH003werestudied.Culture timeofseed liquid wasdetermined.The experimentsofsingle factorand orthogonal design were carried out to optimize the compositions of bioconversion and cultivation conditions for 2-phenylethanol production.The optimized medium contains 120 g/L glucose，5 g/L yeast extract，8 g/L L-phenylalanine，0.2 g/LMgSO4，0.05mol/L KH2PO4and 0.05mol/LK2HPO4.Incubated at28℃and 200 r/min for24 h，the yield of2-phenylethanol reached up to 4.37 g/L，increased by 30.1%compared with the original condition.

Keywords：2-phenylethanol；Saccharomycescerevisiae；optimization；bioconversion