進展性腦梗死外周血炎癥免疫因子m RNA表達的臨床研究

孫志華,賀 婕,黃 淮

進展性腦梗死外周血炎癥免疫因子m RNA表達的臨床研究

孫志華,賀 婕,黃 淮

目的探討急性進展性腦梗死與炎癥免疫因子基因表達的關系。方法對38例進展性腦梗死、90例非進展性腦梗死患者進行白介素6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)mRNA表達測定。結果 進展性腦梗死組IL 6、IL-10m RNA表達水平明顯異常于非進展性腦梗死組(P<0.05)。IL-6m RNA表達水平是腦梗死進展的危險因素。結論 外周血炎癥免疫因子基因表達水平的異常與進展性腦卒中密切相關,可能參與進展性腦梗死的發病過程中。

進展性腦梗死;白介素6;白介素-10;腫瘤壞死因子-α;基因表達

腦梗死后炎癥反應產生的炎癥介質是缺血中心區和周圍區神經元損傷的重要機制之一。本研究檢測急性腦梗死患者血清炎癥免疫因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA表達水平及其他臨床生化指標,探討其與腦梗死的早期進展之間是否相關,期待從新的角度為臨床防治進展性腦梗死提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 入選標準 急性腦梗死患者,符合下列條件:發病48 h內入院;符合第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準,均經頭CT和/或MRI證實;初發腦梗死,既往無神經系統疾病病史。病例排除標準:既往患有免疫系統疾病者、腫瘤者;發病前后存在感染者;發病前后使用激素、免疫抑制劑、非甾體類抗炎藥物者;合并其他臟器嚴重并發癥者(心、肝、腎功能不全者);確診系因動脈炎發病的腦梗死患者。

根據上述入選及排除標準所得急性腦梗死組128例,男性81例,女性47例,年齡44歲～78歲(62.79歲±11.60歲),于入院當時、入院第3天以及第7天進行改良愛丁堡斯勘的那維亞神經功能缺損評分(SSS),采用進展性缺血性腦卒中評定標準:任何2次連續SSS評估時,在意識水平、上下肢運動、眼球運動中,任何1種有大于或等于2分的加重和/或在言語功能中有大于或等于3分的加重。除外腦梗死后出血、發生其他新梗死灶或因嚴重的感染、高熱、心功能不全所致的病情進展,其中進展性腦梗死38例,非進展性腦梗死90例。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 全部患者入院次日清晨空腹即采靜脈血10 ml,血生化指標:血糖(BG)、膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、纖維蛋白原(FIB)、血同型半胱氨酸(HCY)、高敏C反應蛋白(hs-CRP),抽血送至醫院中心實驗室檢測。

1.2.2 血清炎癥免疫因子αm RNA表達的測定

1.2.2.1 標本采集和總核糖核酸(RNA)提取 血液標本采集后3 h內進行總RNA的提取。加入適量的Trizol裂解細胞,再依次加入適量的氯仿、異丙醇、75%乙醇和DEPC水,分別純化、沉淀、洗滌和溶解總RNA。微量分光光度計測定RNA的濃度和純度,吸光度D260 mm/D280 mm>1.80表明純度高,可用于實驗。

1.2.2.2 逆轉錄反應 反應總體積10μL,總RNA模板250 ng～300 ng,25 mmo l/L MgCl22μL,10逆轉錄反應緩沖液1μL,各10 mm ol/L的dNTPs混合物1 μL,RNA酶抑制劑0.25μL,5 U/μL AMV逆轉錄酶0.5 uL,O ligo dT Adap tor 0.5μL,以無RNA酶的滅菌水補充體積到10μL,混勻后稍離心。PCR儀上42℃反應30 min,99℃加熱5 min,冰浴保存備用。

1.2.2.3 熒光定量PCR 由上海生物工程技術公司合成。反應總體積25μL。反應條件:95℃預變性4 min;94℃變性15 s,72℃延伸15 s,40個循環,每一次循環后72℃采集熒光強度數據。(6 5～9 4)℃,每0.5℃讀取一次制備溶解曲線。表達水平以目的基因與內參β-actin的比值表示。

2 結 果

2.1 兩組IL-6、IL-10、TNF-αm RNA表達水平 進展性腦梗死組血清IL-6m RNA表達水平明顯高于非進展性腦梗死組,IL-10m RNA表達水平明顯低于非進展性腦梗死組(P<0.05);TNF-α水平略高于非進展性腦梗死組(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組IL-6、IL-10、TNF-αm RNA表達水平(±s)

表1 兩組IL-6、IL-10、TNF-αm RNA表達水平(±s)

組別n IL 6 IL 10 TNF α 09非進展性腦梗死組90 0.86±0.78 0.69±0.41 1.42±0.89 P <0.05<0.05>0.05進展性腦梗死組38 1.18±0.49 0.51±0.39 1.52±1.

2.2 Logistic回歸分析 只有X1(IL-6 m RNA)、X4 (BG)、X11(hs-CRP)進入到最后的回歸模型,這表明,X1、X4、X11對腦梗死的進展與否影響有統計學意義,X1、X4、X11的參數估計值的符號均為正,可認為它們是預示腦梗死發生進展的危險因素。從其比數比上看出,在因素X4、X11固定不變時,因素X1的水平每增加一個等級(1)所引起的腦梗死發生進展的近似相對危險度為增加前的3.154倍;在因素X1、X11固定不變時,因素X4每增加一個等級(1 mmol/L)所引起的腦梗死發生進展的近似相對危險度為增加前的2.484倍;在因素X1、X4固定不變時,因素X11每增加一個等級(1 mg/L)所引起的腦梗死發生進展的近似相對危險度為增加前的1.856倍。對腦梗死發生進展的相對貢獻:X1>X4>X11。

3 討 論

進展性腦梗死患者臨床癥狀進行性加重的病理生理機制還不太清楚,盡管有一些臨床的、放射學的和生化因素被認為與早期的神經功能惡化有關,但是預測價值大多較低。過度的炎癥反應可加重患者神經細胞缺血缺氧,導致病情惡化和進展[1]。

本課題重點研究進展性腦梗死的細胞因子基因表達方面的改變。血清IL-6是一種在機體防御、急相反應、免疫反應和造血反應等過程中起重要作用的多效細胞因子。IL-6可以刺激急性期反應蛋白合成增多,黏附分子表達增加,直接損傷血管內皮細胞和神經細胞;并促進凝血狀態和血管收縮;使興奮性氨基酸、一氧化氮釋放量增加,加重腦組織水腫、神經細胞壞死和凋亡[2]。本研究結果顯示,進展性腦梗死在臨床癥狀惡化前其血清IL-6m RNA表達水平明顯高于非進展性腦梗死,提示IL-6參與局灶性腦缺血后的急性反應,與早期的臨床癥狀加重有關。經回歸分析也表明IL-6m RNA表達水平是腦梗死進展惡化的獨立危險因素。

Kucharzik等[3]發現,IL-10可抑制單核細胞趨化蛋白的表達,后者在動脈硬化過程中早期參與介導單核細胞的聚集。體外實驗也表明[4],IL-10缺陷小鼠比正常小鼠的神經皮質細胞對興奮毒性和低糖低氧更易受到損傷。外部給予或內源產生的IL-10對腦缺血有神經保護作用。本研究結果表明,IL-10m RNA表達水平的降低與腦梗死發生有一定關系。預先應用TNF-α可提高腦缺血耐受性,達到與缺血預處理相同的神經保護效果[5,6]。TNF-αm RNA表達水平在進展性腦梗死組的研究中,未見明顯增高趨勢,回歸分析亦不提示為進展性卒中的危險因素,說明TNF-α水平與缺血性卒中神經功能惡化的關系不明顯,與國外文獻報道一致。

高水平的IL-6 m RNA表達和低水平的IL-10m RNA表達在腦梗死的發病中具有重要作用。對炎癥因子在腦梗死發病中作用的研究,特別是進展性腦梗死及其關系的研究,有助于揭示腦梗死發病以及其神經功能惡化的病理生理過程,并為臨床防治進展性腦梗死發生和減輕其急性期應激反應、保護缺血神經元提供一定的理論依據。應用炎性因子的抗體對腦梗死患者進行治療,有可能是今后治療缺血性腦卒中的一條重要途徑。

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Clinical Study of Inflammatory Immune Factors mRNA Expression in Patients with Progressive Cerebral Infarction

Sun Zhihua,He Jie,Huang Huai
Central Hospita l of China Petro leum and Natura l Gas Genera l Corporation,Langfang 065000,Hebei,China

ObjectiveTo investigate the relationship of progressive cerebral infarction(PCI)with seruminflammatory immune factors gene exp ression.MethodsThirty-eight patients with PCIand 90 patients with stabile cerebral infarction were enro lled.The leve ls of interleukin(IL)6,IL 10,tumor necrosis factorα(TNFα)gene expression were measured.ResultsThe levels of IL 6,IL 10 m RNA expression had more significant difference in patients with PCI than that in stabile cerebra l infarction.Gene expression of IL-10 was the risk factor in PCI.Conc lusionThe abnorma l levels of inflamm atory immune factorsm RNA expression may be c losely re lated to PCI.They may p lay an important role in progressive ischem ic stroke.

progressive cerebral infarction;interleukin-6;interleukin-10;tum or necrosis factor-α;gene exp ression

R743 R255

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.05.009

1672-1349(2015)05-0583-02

2014-05-29)

(本文編輯 王雅潔)

中國石油天然氣集團公司中心醫院(河北廊坊065000),E-m ail:986932458@qq.com