倒卵葉五加多糖的羧甲基化工藝及抗氧化性

趙鵬，張婷婷，宋逍，唐志書

（陜西中醫學院藥學院，陜西 咸陽 712046）

倒卵葉五加（Acanthopanax obouatus Hoo）屬五加科（Araliaceae）五加屬植物，分布于陜西、寧夏、甘肅等地，多糖是其主要的活性成分之一，具有明顯的調節機體免疫、抗氧化性等生物活 性[1-3]。目前對于倒卵葉五加多糖的研究主要集中在分離純化、藥理活性等方面，而對其進行衍生化方面的研究尚未見報道。

對于多糖進行衍生化的方法主要包括物理法、化學法及生物法等。利用化學的方法對多糖的分子結構進行修飾，能夠提高其生物活性，甚至賦予其新的生物活性。正因為如此，對于多糖的衍生化研究已成為多糖研究者重點關注的熱點之一[4-8]。

本研究在前期對倒卵葉五加多糖分離純化的研究基礎之上，利用響應面法對倒卵葉五加多糖羧甲基化修飾的合成工藝條件進行了優化研究，并初步研究了羧甲基化后多糖的抗氧化性，考察羧甲基化修飾對倒卵葉五加多糖抗氧化活性的影響。本研究成果為把倒卵葉五加多糖及其羧甲基化衍生物開發成為新型、安全、天然的藥品、功能性食品添加劑提供了一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

倒卵葉五加購自西安萬壽路中藥材批發市場，氯乙酸、異丙醇、乙醇、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚及其他試劑均為國產分析純。

UV-2501PC 紫外可見分光光度儀，日本島津公司；FA2004 電子天平，上海精科天平廠；H2050R 臺式離心機，湖南湘儀公司；ALPHA1-4型真空冷凍干燥機，德國CHRIST 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 倒卵葉五加多糖的制備

將倒卵葉五加在80℃下干燥，粉碎后過60 目篩。再將其用無水乙醇在回流下脫脂兩次，過濾，濾渣晾干后，用雙蒸水，按料液比1∶15（g/mL）80℃下提取2次，提取液合并，再按1g生藥材濃縮為1mL 進行濃縮，濃縮液經脫蛋白、脫色處理后醇沉，即得倒卵葉五加粗多糖，用水復溶后，再用Sephadex G-100 凝膠柱進行純化，收集多糖富集峰，濃縮后凍干即得倒卵葉五加多糖，經測定該多糖含量為98.4%（質量分數），經高效凝膠色譜法檢測，其為均一多糖，分子量為8.7kD。

1.2.2 倒卵葉五加多糖的羧甲基化

參照文獻[4]的方法，先精確稱取一定量的多糖樣品，加入適量異丙醇與20%的NaOH 的混合溶液將其溶解；再將氯乙酸溶于異丙醇中，并加入適量的20%的NaOH 溶液混合均勻。在一定溫度下，往多糖溶液滴加一定量氯乙酸的異丙醇溶液。滴加完畢，恒溫反應一段時間后，待反應結束，冷卻至室溫，再用鹽酸溶液將反應液調為中性。將反應液裝入截留相對分子質量為3500 的透析袋中用流動水透析48h。透析液濃縮后即得羧甲基化修飾的倒卵葉五加多糖。

1.2.3 倒卵葉五加多糖羧甲基化取代度的測定

參照文獻[4]，測定羧甲基化倒卵葉五加多糖的取代度。

1.2.4 抗氧化性能測試

參照文獻[9]測試樣品對超氧陰離子和羥自由基的清除效果。

2 結果與討論

2.1 倒卵葉五加多糖羧甲基化的合成工藝

2.1.1 反應時間的影響

預設反應溫度50℃，氯乙酸濃度為2.0mol/L，確定最優的反應時間，結果見圖1。

圖1 所示的結果說明，當反應時間為1.0～4.0h時，多糖羧甲基化取代度的值快速增大，當反應時間為4.0h時，達到最大。隨著反應時間的進一步延長，副反應也在增多，使得氯乙酸的利用率反而降低，并且當時間過長時，反應條件下，多糖的降解程度也在增加，從多糖的取代度及穩定性考慮，因此確定最優的反應時間為4.0h。

2.1.2 氯乙酸濃度的影響

預設反應溫度50℃，反應時間為4.0h，確定最優的氯乙酸濃度，結果見圖2。

圖2 所示的結果說明，隨著氯乙酸濃度的逐步增加，多糖羧甲基化取代度的值逐漸提高，在此階段氯乙酸與氫氧化鈉生成氯乙酸鈉來進攻多糖的活性中心，而生成羧甲基化的多糖，此時生成的氯乙酸鈉越多，多糖的羧甲基化取代度就越高。但隨著氯乙酸濃度的增大，體系內的氫氧化鈉已經完全轉化為氯乙酸鈉后，其對多糖羧甲基化取代度的影響就不是很大了，而且酸性過強，易于引起多糖的降解，因此確定最優的氯乙酸濃度為3.0mol/L 左右。

2.1.3 反應溫度的影響

預設反應時間為 4.0 h、氯乙酸濃度為3.0mol/L，確定最優的反應溫度，結果見圖3。

圖1 反應時間的影響

圖2 氯乙酸濃度的影響

圖3 反應溫度的影響

圖3 所示的結果說明，隨著反應溫度的增加，多糖羧甲基化取代度的值逐漸增大，當到70℃達到最大。隨著溫度的進一步提高，取代度反而降低，這是因為開始隨著溫度的提高，反應速率增加，但隨著溫度的進一步增加，副反應速率也在增加，使得氯乙酸的利用率反而降低，并且當溫度過高時，反應料液顏色加深，反應條件下，溫度過高還能導致多糖的降解，因此反應應在70℃左右 進行。

2.1.4 倒卵葉五加多糖羧甲基化工藝條件優化

本研究按照Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，在單因素實驗的基礎之上，以羧甲基取代度（DS）為響應值，選取反應時間、氯乙酸的濃度和反應溫度等3 個對反應具有較大影響的單因素進行響應面實驗，來優化倒卵葉五加多糖羧甲基化的工藝條件。實驗因素和水平設計如表1 所示，響應面得到的實驗及分析結果如表2 和表3 所示。

采用Design-Expert 7.01 軟件對響應面優化試驗得到的結果進行分析研究，試驗結果見表2，按照各因素對取代度（y）的影響進行二次方程擬合，擬合得到式（1）。

由方差分析表3 的分析結果可以看出，回歸方程的F 值為39.41，其顯著水平遠遠低于0.05，這說明，利用響應面法擬合得到的試驗模型顯著型極高，按照擬合模型得到的回歸方程，考察其因變量與自變量之間的線性相關系數后發現，r=0.9846，這一點表明用該數學模型來評估各相關因素對倒卵葉五加多糖羧甲基化取代度的影響相對準確。對表3 的方差分析結果可以看出，響應面試驗組合的各單因素中，對倒卵葉五加多糖羧甲基化取代度的影響最大的是反應溫度，其次是氯乙酸濃度，反應時間的影響最小，各因素之間的交互影響并不明顯。

表1 實驗因素水平表

表2 響應面分析實驗方案及實驗結果

表3 方差分析表

2.1.5 響應面圖分析

通過響應面優化實驗分析可以得到相應的響應面圖，響應面圖可以更加直觀的反應出各單因素對倒卵葉五加多糖羧甲基化取代度的影響結果以及各單因素之間交互影響的強弱關系。響應面實驗得到的等高線圖見4～圖6。

圖4 氯乙酸濃度與反應時間對倒卵葉五加多糖羧甲基化 取代度的影響

圖5 反應溫度與反應時間對倒卵葉五加多糖羧甲基化 取代度的影響

圖6 反應溫度與氯乙酸濃度對倒卵葉五加多糖羧甲基化 取代度的影響

對比圖4～圖6 可知：反應溫度對倒卵葉五加多糖羧甲基化的取代度的影響極為顯著，圖中可看出其繪制的曲線最為陡峭；氯乙酸濃度對羧甲基化的影響次之，而影響最小的則是反應時間，相較于氯乙酸濃度而言，其曲線較為平滑一些。通過響應 面法預測得到的回歸模型分析[10-11]， 可預測得到倒卵葉五加多糖羧甲基化的最優合成工藝條件是：反應時間是4.11h，氯乙酸濃度是3.26mol/L，反應溫度是76.42℃，預測的工藝條件下，得到的羧甲基化多糖的取代度為0.559。

2.1.6 驗證實驗

按照上述預測的結果，從實驗操作的可操作性考慮，微調上述工藝條件為：反應時間4.1 h，氯乙酸濃度是3.3 mol/L，反應溫度75℃。分別用0.1 g 的倒卵葉五加多糖，在微調后的羧甲基化修飾的工藝條件下，做3 次多糖羧甲基化平行試驗，得到的羧甲基化倒卵葉五加多糖基取代度的平均值為0.557，實驗結果表明，通過回歸方程預測得到的工藝條件與實際操作工藝條件十分吻合。

2.2 羧甲基化倒卵葉五加多糖的抗氧化活性

2.2.1 羥自由基的清除實驗

本研究以Vc 作為陽性對照品，分別考察了倒卵葉五加多糖羧甲基化修飾前后對羥自由基的清除作用，實驗結果見圖7。

由圖7 可知，經過羧甲基化修飾后的倒卵葉五加多糖清除羥自由基的最大清除率為71.3%，比羧甲基化前多糖的最大清除率46.3%提高了25.0%，清除羥自由基的能力有了明顯的提高，其最大清除率基本可達到陽性對照品Vc 的水平。

2.2.2 超氧陰離子的清除實驗

本研究以Vc 作為陽性對照品，分別考察了倒卵葉五加多糖羧甲基化修飾前后對超氧陰離子的清除作用，實驗結果見圖8。

由圖8 可知，經過羧甲基化修飾后的倒卵葉五加多糖清除超氧陰離子的最大清除率為90.3%，比羧甲基化前多糖的最大清除率26.2%提高了64.1%，清除超氧陰離子的能力也有了明顯的提高，但其清除超氧陰離子的能力不及陽性對照品Vc。

圖7 羥自由基的清除實驗

圖8 超氧陰離子的清除實驗

上述抗氧化性實驗結果說明，羧甲基化修飾倒卵葉五加多糖，可有效地提高其抗氧化活性，這也許是對倒卵葉五加多糖進行羧甲基化后，其溶解性以及空間構象發生了改變，從而改善了多糖的抗氧化活性，對于其具體的原因還在進一步研究之中。

3 結 論

通過對倒卵葉五加多糖進行羧甲基化修飾的工藝路線進行研究，使用響應面分析方法優化了其最優的修飾工藝條件，結果表明：反應時間4.1h，氯乙酸濃度是3.3mol/L，反應溫度75℃，在此條件下修飾制得的羧甲基化倒卵葉五加多糖的羧甲基化取代度為0.557，利用該方法對多糖進行羧甲基化修飾，具有反應可操作性強、試劑價廉易得、多糖的羧甲基化取代度較高的優點，是一種較理想的多糖羧甲基化修飾方法。通過倒卵葉五加多糖羧甲基化衍生物超氧陰離子和羥自由基的清除實驗表明，經過羧甲基化修飾后的抗氧化能力較之羧甲基化修飾前的倒卵葉五加多糖有了非常明顯的改善，其抗氧化能力進一步增強，關于羧甲基化能顯著增強多糖抗氧化性的原因還在進一步深入研究之中。