硅藻土負載異養硝化-好氧反硝化菌的脫氮性能

喬楠，陳瑞佳，于大禹

（1 東北電力大學建筑工程學院，吉林 吉林 132012；2 東北電力大學化學工程學院，吉林 吉林 132012）

隨著環境水體富營養化問題的日益嚴重，人們對排放污水的脫氮問題愈加重視。近年來，一種新型脫氮菌，即異養硝化-好氧反硝化菌逐漸成為污水脫氮領域的研究熱點。該菌可同時將硝化和反硝化過程在一個反應器中完成，克服了傳統脫氮工藝高成本、高耗能、低效率等問題，因此具有很大的研究價值和應用前景。

目前，已陸續有不同分屬的異養硝化-好氧反硝化菌如不動桿菌、紅球菌、枯草芽孢桿菌等被從不同環境中分離出來[1-2]。對其開展的研究也多集中于菌株的脫氮特性及機理，有研究者對一株好氧反硝化菌H1 的脫氮性能及機理進行了初步研究[3]，發現在有氧條件下，該菌可在氨單加氧酶的作用下將NH4+-N 氧化為NH2OH，再經過羥胺氧化酶的作用將其轉化為N2O，以氣體形式逸出水體，提高了對NH4+-N 的降解效率，但對其實際應用有待進一步探索。固定化技術能夠解決實際脫氮工藝中菌體流失、脫氮穩定性差等問題[4]，目前對于異養硝化-好氧反硝化菌的固定化已有一定的研究基礎，使用過的材料包括活性炭、納米Fe3O4、聚乙烯醇等[5-6]，尋求高效、廉價、耐用且無二次污染的菌株固定化載體成為進一步推進該菌應用研究的關鍵。硅藻土是一類廉價好用的吸附劑，其表面具有大量的、有序排列的微孔，從而具有很大的比表面積[7]，將其作為生物載體應用于廢水處理中，由于硅藻土本身可以吸附污染物，因此可以達到強化生化反應的效果，極具應用價值[8]。本實驗采用經適當改性后的硅藻土負載異養硝化-好氧反硝化菌，優化固定化條件的同時考察不同環境因素對固定化菌脫氮性能的影響，之后將該固定化菌投入到反應器中處理生活污水，研究其脫氮效果及穩定性。

1 材料方法

1.1 材料

（1）實驗菌種 H1（實驗室自篩），經測定該菌種具有異養硝化和好氧反硝化性能，經菌株鑒定為假單胞菌[9]。

（2）H1 生長培養基 KNO3，0.6g/L；KH2PO4，1.0g/L；MgSO4·7H2O，1.0g/L；琥珀酸鈉，2.4g/L；pH7.0。

（3）NH4+模擬廢水 (NH4)2SO4，0.35g/L；KH2PO4，0.75g/L；K2HPO4·3H2O，2.216g/L；MgSO4·7H2O，0.025g/L；檸檬酸三鈉，1.81g/L；pH7.0。

（4）生活廢水 取自吉林市長春路旁居民樓生活廢水。其中總氮含量為70～75mg/L；COD 含量為470～481mg/L；氨氮含量為41～46mg/L。

1.2 方法

1.2.1 分析檢測項目及方法

參照《水和廢水監測分析方法》[10]，其中：總氮（TN），過氧化鉀氧化-紫外分光光度法；氨氮 （NH4+-N），納氏試劑分光光度法；硝態氮（NO3--N），紫外分光光度法；亞硝態氮（NO2--N），N-(1-萘基)-乙二胺光度法；COD，重鉻酸鉀法；菌懸液中微生物數量，稀釋平板計數法。

1.2.2 H1 的固定化

（1）硅藻土的改性[11-12]①取50g 硅藻土在200℃下干燥4h，冷卻至室溫后按2.5∶1 的液固比稱取硅藻土和水，攪拌均勻后加入濃度為40%硫酸，水浴溫度100℃條件下充分攪拌4h，過濾后用除鹽水洗滌至中性，105℃下烘干；②向其中加入一定濃度的碳酸鈉溶液，邊攪拌邊滴加飽和氯化鈣溶液，反應結束后真空抽濾；③將干燥后的硅藻土與FeSO4按一定的質量配比加入除鹽水中，30℃下以150r/min 的速度攪拌2h，過濾，干燥2h 即得到改性硅藻土。

（2）菌株H1 的負載 取經搖床培養24h 的菌懸液300mL，3000r/min 離心20min，PBS 緩沖液洗滌3 次后，使用無菌水稀釋至50mL，根據不同實驗要求加入改性硅藻土，改變實驗條件，在恒溫水浴搖床中120r/min 振蕩進行吸附實驗，溶解氧（dissolved oxygen，DO）控制在5.0mg/L，待硅藻土顆粒沉降完全后吸取上清液并稀釋，接種到平板恒溫培養，48h 后對平板上的菌落計數為C1，初始菌懸液菌落計數為C0，根據公式Q1= (C0-C1)/C0× 100%，計算出菌體固定化率。

1.2.3 環境因素對固定化H1 脫氮效果的影響

抗環境干擾能力是衡量固定化菌脫氮性能的重要指標，因此本實驗研究比較了DO 濃度分別為1.4mg/L、5.1mg/L、6.8mg/L；溫度分別為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃，pH 值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 條件下，游離菌及固定化H1 在反應器中對NH4+模擬廢水的處理效果，24h 后檢測水中NH4+-N、NO3--N、NO2--N 及COD 的變化。

1.2.4 實驗裝置

本實驗裝置如圖1 所示，由好氧區、固液分離區組成。好氧區容積為5.0L，固液分離區容積為0.7L，好氧區投加改性硅藻土固定化菌，在底部一側布置曝氣頭，DO 控制在6mg/L，溫度控制在 25℃。

圖1 實驗裝置圖

1.2.5 改性硅藻土固定化H1 連續式處理生活污水

調節蠕動泵，控制進水流速為2mL/min，連續對廢水進行14 天的處理，共處理40L 污水，一次性投加10g 負載H1 的硅藻土，每隔24h 將分離室中沉降的硅藻土回流到反應室中，DO 控制在6.0mg/L 左右，每隔24h 監測水中TN、NH4+-N、NO2--N 及COD 的變化。

2 結果與討論

2.1 改性硅藻土固定化H1 效能的研究

2.1.1 吸附時間（t）及硅藻土用量對H1 固定化效果的影響

m(FeSO4)/m(硅藻土)=5.0%、溫度為 30℃、pH=7.0 時，采用1.2.2 節方法考察時間及硅藻土用量對H1 固定化效果的影響。實驗結果見圖2。

從圖2(a)可以看出，隨著時間的增加，硅藻土對菌株的固定化率呈先上升后下降的趨勢，在初始時間里，吸附過程較快，孔道效應明顯；在18h 后，吸附效率下降；又經6h，硅藻土對于菌株H1 的吸附已達到飽和狀態，固定化率達到最大為68.16%；如果增加時間超過30h，固定化率反而下降，這可能是由于環境中營養物質匱乏，菌株無法進行生長增殖，菌與菌之間的黏結力下降，在搖床振蕩條件下H1 逐漸從硅藻土表面脫落，因此選定固定化時間為24h。從圖2(b)可以看出，硅藻土用量的增加提供了更多的吸附孔道和比表面積，因而吸附量也隨之增加，在菌懸液濃度一定條件下，當投加量為0.06g/mL 時，固定化率達到63.84%；當投加量繼續增加時，固定化率下降到45.16%，這可能是由于在本實驗所設的吸附條件下，繼續增加硅藻土投加量反而會降低其懸浮效果，使部分硅藻土處于沉降狀態，降低與菌體的接觸效率，因此選定改性硅藻土用量為0.06g/mL。

圖2 改性硅藻土固定化H1 條件優化

使用改性硅藻土對H1 進行固定化時，由于硅藻土本身物化特性及菌體代謝活性都會受到環境條件的影響，除pH 值及溫度外，在本實驗中，硅藻土改性時使用的FeSO4劑量也會影響菌體活性，因此本研究結合菌體固定化率及固定化菌的脫氮性能，考察分析了Fe2+加入量、pH 值、溫度及DO 對固定化H1 效能的影響。

2.1.2 FeSO4劑量對固定化菌H1 效能的影響

溫度為30℃、投加量為0.06g/mL、固定化時間為24h、pH=7.0、DO=5.0mg/L、硅藻土質量一定時，設置FeSO4占硅藻土質量分數分別為10.0%、7.0%、5.0%、3.0%、2.5%、2.0%、0，考察不同用量FeSO4的條件下，改性硅藻土顆粒對H1 固定化及生化活性的影響。實驗結果見表1。

表1 的結果顯示，加入FeSO4能夠明顯改善固定化率，當m(FeSO4)/m(硅藻土)=0 時，即不添加FeSO4進行改性，固定化率僅為 38.02%；而m(FeSO4)/m(硅藻土)=2.5%時，H1 負載率提升到60.91%，這是由于加入的Fe2+取代了硅藻土表面的硅羥基，使得硅藻土表面帶有正電荷，這樣提升了對菌體的吸附性。當m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%時，在上述實驗條件下，固定化率基本保持恒定，為59.75%，但固定化菌對NH4+-N 的去除率達到最高，為61.62%，表明此時固定化H1 活性更強。據之前報道，金屬離子能夠通過共價作用來激活酶的催化能力，適量的Fe2+會對菌株異養硝化過程有一定激活作用，通過激發異養硝化過程中關鍵的溶解性單體周質酶及羥胺氧化酶的活性來提高脫氮效果[3]，可見經改性后的硅藻土對菌株的吸附效果不僅增強，同時強化了菌株的脫氮性能。此外，隨著m(FeSO4)/m(硅藻土)增加到5.0%，固定化率也上升到62.10%，但固定化H1 對NH4+-N、CODCr的降解率出現明顯下降，雖然Fe2+的加入提高了硅藻土對菌株的吸附效果，但過量的Fe2+可能會對H1 的活性造成一定影響[13]。根據以上實驗結果，選定硅藻土改性過程中，m(FeSO4)/m(硅藻土)的最佳比例為3.5%。

2.1.3 pH 值對固定化菌H1 效能的影響

m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%、溫度為30℃、改性硅藻土投加量為0.06g/mL、固定化時間為24h，設置pH 值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。圖2(c)為不同pH 值對H1 固定化率的影響；圖3 為不同pH 值對固定化H1 脫氮性能的影響。

從圖2(c)及圖3(a)可以看出，pH=5.0 時，固定化率僅為40.66%，固定化菌對NH4+-N 去除率也維持在較低水平，在偏酸條件下，由于硅羥基等活性基團從硅藻土表面解離出來變得更加困難[14]，因而可能抑制了其對菌體的吸附，此時游離菌COD 降解率僅為70.30%，表明H1 在酸性條件下新陳代謝能力下降，不利于菌體表面活性官能團在改性硅藻土表面微孔中的附著。由圖3(b)看出，投加固定化菌的廢水中 NO3--N 含量高達 0.68mg/L，表明NO3--N 的還原受到抑制，這可能是由于在酸性條件下，微生物對營養物質的吸收及體內的反硝化酶活性都相應受到影響[15]。固定化過程改變了細胞的生長環境，載體對于固定于其中的微生物細胞起到了緩沖作用，因而在酸性條件下固定化H1 較游離態H1 效能有所提高，對NH4+-N 去除率達到65.30%。當pH 值處于中性或弱堿性條件時，固定化率上升到65.97%，較pH=6 時對菌體的固定化率提高15%，固定化菌NH4+-N 降解率達到69.28%。

表1 不同m(FeSO4)/m(硅藻土)比例下H1 的固定化效果

圖3 不同pH 值下固定化H1 脫氮性能測定

2.1.4 溫度（T）對固定化菌H1 效能的影響

m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%、改性硅藻土投加量為0.06g/mL、pH=7.5、固定化時間為24h 條件下，分別設定溫度為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃，實驗結果見圖2(d)、圖4。

圖4 不同溫度下固定化H1 脫氮性能測定

結合圖2(d)、圖4(a)，在低溫環境下，外界溫度為10℃時，固定化率僅為50%，由于菌體代謝速率下降，導致對NH4+-N 降解率較低，僅為51%左右。從圖4(b)看出，NO3--N、NO2--N 出現積累，表明參與硝化及反硝化過程的各種酶活性都受到了不同程度的抑制，但相比之下固定化菌對NH4+-N的降解率較游離菌略有提升，為55.36%，表明載體在低溫條件下對菌體起到了一定保護作用，降低了低溫環境對菌體株的影響。隨著溫度升高，硅藻土表面硅羥基及H1 逐漸變得活躍，吸附效果也逐漸增強，在溫度接近30℃時，硅藻土對H1 的吸附趨于平衡階段，但當溫度高于40℃時，圖4(a)、圖4(b)結果表明，NH4+-N 去除率出現明顯下降，同時NO2--N 含量有積累的趨勢，而NO3--N 并無明顯上升，說明相比于硝酸鹽還原酶，亞硝酸鹽還原酶對于高溫更加敏感[16]，而投加固定化菌的廢水中NO2--N 積累量更少，表明固定化菌較游離菌對高溫的耐受性增強，脫氮更徹底。

2.1.5 DO 對固定化H1 效能的影響

根據Wehrfritz 等[17]提出的異養硝化-好氧反硝化偶聯機制，O2在異養硝化過程中伴隨著氨單加氧酶（AMO）和羥胺氧化酶（HAO）參與反應，同時在好氧反硝化過程中參與協同呼吸，是整個脫氮過程中必要的底物，因此是影響異養硝化-好氧反硝化菌脫氮效果的主要因素。至今發現的不同菌株對DO 敏感性也不盡相同，但針對DO 對于固定化菌的影響鮮有報道。本實驗通過調節曝氣泵的強度控制DO 分別為1.4mg/L、5.1mg/L 和6.8mg/L，采用1.2.4 節方法比較DO 對于固定化H1 及游離菌脫氮過程的影響。

從圖5(a)可以看出，隨著DO 濃度的升高，游離菌及固定化菌對NH4+-N 及COD 的去除率明顯增加，但圖5(b)表明，NO3--N、NO2--N 也隨之有較多積累，當DO 從5.1mg/L 升高到6.8mg/L 時，游離菌及固定化菌NH4+-N 去除率分別增加22.08%和30.96%。根據之前報道，高濃度的DO 利于提高氨單加氧酶及羥胺氧化酶活性，但有可能改變了脫氮途徑，使得羥胺從可直接轉換為N2O 轉變為需經反硝化過程（NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→N2O→N2）去除[18]。當DO=6.8mg/L，固定化菌的NH4+-N 去除率可達69.01%，略高于游離菌，而NO3--N 及 NO2--N 含量分別為 2.05mg/L 和0.51mg/L，都遠低于游離菌，因為硅藻土依靠吸附作用將菌株固定于其內部和表面，菌體對于氧的消耗由外至內形成了DO 梯度，內部的缺氧或微氧區緩解了氧氣對于亞硝酸鹽還原酶的抑制，使得脫氮過程得以順利進行，因此，硅藻土固定化H1 對于高濃度DO 有更強的耐受性，脫氮效率更高。

圖5 不同DO 條件下固定化H1 脫氮性能測定

2.2 硅藻土固定化H1 在反應器中連續處理生活 污水

處理結果如圖6 所示。從圖6 中可以看出，反應器啟動時間為5 天，在啟動期間，TN、NH4+-N、COD 去除率快速上升，NO2--N 含量波動較大；8天后，TN、NH4+-N去除率分別達到52.40%、55.64%，TN 去除率與NH4+-N 去除率基本保持同步，COD去除率為61.23%；8 天之后反應器中氮碳污染物去除效果趨于穩定，NO2--N 濃度在0.02mg/L 上下波動，維持在較低水平。實驗證明，利用硅藻土固定化異養硝化-好氧反硝化菌在一個反應器中對生活污水有較好的連續處理效果。

3 結 論

（1）通過改性硅藻土對異養硝化-好氧反硝化菌H1 固定化的研究，確定了最佳固定化條件：吸附時間為24h，載體投加量為0.06g/mL，溫度為30℃，pH 值為7.5；同時發現當m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%時，固定化率及固定化后菌體活性較高，使用適量Fe2+改性后的硅藻土作為載體可強化菌株的異養硝化性能。

圖6 硅藻土固定化H1 連續處理生活污水 TN、NH4+-N、NO2--N 濃度及COD 去除率

（2）通過比較游離菌和固定化菌對環境因子耐受性的研究，結果表明在低溫和酸性條件下，載體對于H1 起到緩沖保護作用。相比于游離菌，當DO升高時，投加固定化菌的NH4+模擬廢水中NO2--N積累量更少，脫氮效率更高，表明固定化菌對環境的耐受性更強。

（3）固定化菌在反應器中連續運行8 天之后氮碳污染物去除效果趨于穩定，并且沒有NO2--N 的積累，表明硅藻土固定化H1 適用于對污水的連續處理。

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