南赤瓟醇提物對(duì)裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的抑制作用

王愛玲 王海燕 覃慧林 馮天艷 賀海波 楊小姣 鄧 為 汪鋆植

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 ＆湖北省土家醫(yī)藥研究所，湖北 宜昌 443002；2.湖北省宜昌市中醫(yī)醫(yī)院 ＆三峽大學(xué) 中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；3.神農(nóng)架聚能藥業(yè)有限公司，湖北 神農(nóng)架 422400）

南赤瓟為葫蘆科植物Thldianthanudiflora Hemsl.的根，又名野南瓜、毛土瓜、球子蓮，四棍汝等，其性味苦，涼，具有清熱解毒、理氣活血、瀉熱祛瘀、消腫散結(jié)、止痢通乳的功效［1］，民間主要用于治療癰腫、腸炎、痢疾、毒蛇咬傷、通乳及婦科疾病.在前期研究中，發(fā)現(xiàn)南赤瓟水提物和醇提物可顯著誘導(dǎo)Hela和 Caski細(xì)胞凋亡［2－3］.本研究擬在此基礎(chǔ)上通過裸鼠宮頸癌Caski移植瘤模型，觀察南赤瓟醇提物對(duì)裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的抑制作用，并在此基礎(chǔ)上探尋其可能的機(jī)制，以期為其用于宮頸癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 南赤瓟醇提物的制備

南赤瓟醇提物的制備參見前期研究報(bào)道［3］.實(shí)驗(yàn)時(shí)將南赤瓟醇提物干浸膏，實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度.

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

人宮頸癌Caski細(xì)胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供；雌性BALB／c－nu裸鼠15只，4～6周齡，體重18～22g，由武漢大學(xué)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周后即進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn).

1.3 藥品及主要試劑

RPMI－1640，美國Gibco公司；胎牛血清，杭州四季青生物材料有限公司；HEPES，胰蛋白酶，美國Amresco公司；Annexin V－FITC，晶美生物工程有限公司；Trizol，美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit），日本 TaKaRa公司，Bcl－2、Bax、Caspase－9、Caspase－3和 GAPDH（引物序列見表1）、即用PCR擴(kuò)增試劑盒（Tap DNA Polymerase），生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑均為市售分析純.

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的建立

Caski細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生小牛血清、105U／L青霉素、100mg／L鏈霉素的 RPMI－1640培養(yǎng)基中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度條件下培養(yǎng)，待Caski細(xì)胞貼壁生長，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度至4×107個(gè)／mL，裸鼠于右側(cè)后腿背部皮下注射0.3mL／只單細(xì)胞懸液，注射局部出現(xiàn)明顯皮丘，一周內(nèi)注射2次.待腫瘤長出后，每日測(cè)量腫瘤體積，待瘤體生長至大于100mm3時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組

待瘤體生長至大于100mm3后，將裸鼠完全隨機(jī)分為3組：模型組，南赤瓟醇提物組（200mg／kg）和南赤瓟醇提物組（400mg／kg），每組5只，每組灌胃給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)給藥4周.

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠一般情況的影響

每3d測(cè)量1次裸鼠體重、飲食量、飲水量，每天觀察裸鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)力、反應(yīng)、腫瘤生長情況、大便形態(tài)等.分組后第2d（d1）開始測(cè)量各組移植瘤的長度（L）和寬度（W），每3d測(cè)量1次，腫瘤體積（V）＝（L×W2）／2，以觀測(cè)時(shí)間（d）作為橫軸，瘤體積的均值（mm3）為縱軸繪制移植瘤生長曲線.

1.5.2 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影響

停藥后24h將裸鼠脫頸法處死，完整剝出瘤組織，觀察各組瘤塊情況及有無周圍組織浸潤，常規(guī)剖腹觀察有無腹水及其它臟器轉(zhuǎn)移，稱瘤體重量，計(jì)算抑瘤率.抑瘤率＝［1－（治療組瘤重／對(duì)照組瘤重）］×100%.

1.5.3 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響

取瘤組織約10mm3，用4℃的PBS清洗2次，用眼科剪反復(fù)剪碎組織塊后，200目尼龍網(wǎng)過濾2次，制成單細(xì)胞懸液；取2×107細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，具體方法參見Annexin V－FITC試劑盒說明書.

1.5.4 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

取瘤后，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色后，置于光鏡下觀察各組裸鼠移植瘤組織的形態(tài)學(xué)變化.

1.5.5 南赤瓟醇提物對(duì)腫瘤組織 Bcl－2、Bax、Caspase－3和Caspase－9mRNA表達(dá)的影響

用Trizol試劑提取移植瘤組織總RNA，具體方法遵照說明書進(jìn)行，然后將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；在RNase Free處理過的反應(yīng)管中加入SYBR? Premix Ex TaqTM II（2X）12.5μL，PCR Forward Primer（10μM）1μL，PCR Reverse Primer（10μM）1 μL，DNA 模板2μL，滅菌蒸餾水8.5μL，最終反應(yīng)體系為25μL.將樣品放入實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀中按95℃預(yù)變性30s、95℃變性5s、退火30s、72℃延伸20 s條件擴(kuò)增30次.利用PCR儀匯出擴(kuò)增曲線，進(jìn)行結(jié)果分析.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用One－Way ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn).

2 結(jié) 果

2.1 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠一般情況的影響

Caski細(xì)胞接種后第10d起，裸鼠右側(cè)后腿背部出現(xiàn)黃豆大小的移植瘤，15只裸鼠全部成瘤，用藥前各組間平均腫瘤體積大小無顯著性差異（P＞0.05）.用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，各組裸鼠的進(jìn)食量、飲水、大小便均正常，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常，反應(yīng)敏捷，皮膚顏色如常，移植瘤組織未見破潰.

2.2 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤體積的影響

由圖1可見，模型組的移植瘤生長迅速，用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，腫瘤體積雖然繼續(xù)增大，但生長速度明顯變緩，從治療后第7d開始，與模型組比較，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且隨著治療時(shí)間的延長，其療效愈加明顯.

圖1 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤體積的影響（與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.3 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

由表2可知，模型組瘤體積和瘤重明顯增加，用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，其瘤重明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；其抑瘤率隨劑量的增加而逐漸增高，與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.01）.

表2 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠瘤重、抑瘤率和細(xì)胞凋亡的影響（x±s，n＝5）

2.4 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響

模型組瘤組織的細(xì)胞凋亡率比較低，用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，其腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加，與模型組比較，具有顯著性差異，且隨著南赤瓟提取物劑量增加凋亡率提高（P＜0.01）（見表2）.

2.5 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

圖2 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

由圖2可見：模型組腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核增大，核呈2個(gè)或多個(gè)，大小、形態(tài)不一，核仁清晰，染色質(zhì)增多，核膜顯著增厚；用南赤瓟醇提物治療后，瘤細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞質(zhì)密集，核染色質(zhì)邊集，可見細(xì)胞凋亡，并有壞死區(qū)域出現(xiàn)，而且隨南赤瓟醇提物劑量的增加，凋亡細(xì)胞明顯增多，壞死區(qū)域出現(xiàn)顯著增大.

2.6 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織Bcl－2、Bax mRNA表達(dá)影響

如表3所示，模型組腫瘤組織中Bcl－2mRNA表達(dá)水平明顯增加，Bax mRNA表達(dá)水平明顯降低；用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，Bcl－2mRNA表達(dá)明顯降低，Bax mRNA表達(dá)明顯升高，Bcl－2／Bax的比值降低，與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且隨著南赤瓟醇提物劑量增加而增強(qiáng).

表3 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織Bcl－2、Bax mRNA表達(dá)的影響（x±s，n＝5）

2.7 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織 Caspase－3、Caspase－9mRNA表達(dá)的影響

如表4所示，模型組腫瘤組織中Caspase－3、Caspase－9mRNA表達(dá)水平明顯降低；用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治療后，腫瘤組織中Caspase－3、Caspase－9mRNA表達(dá)水平明顯升高，與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且隨著南赤瓟醇提物劑量增加而增強(qiáng).

表4 南赤瓟醇提物對(duì)Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織Caspase－3、Caspase－9mRNA表達(dá)的影響（x±s，n＝5）

3 討 論

宮頸癌是臨床最常見的婦科惡性腫瘤，由于其惡性程度高，多易復(fù)發(fā)，而且死亡率高，使得當(dāng)前已成為全球性的公共衛(wèi)生問題［4］.據(jù) WHO統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)宮頸癌病例有55.51萬，其中我國就有13.15萬，占新發(fā)病例28.8%［5－6］.尤其應(yīng)該關(guān)注的是，當(dāng)前我國宮頸癌的發(fā)病率不僅出現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，而且呈現(xiàn)底年齡化.因而，在我國宮頸癌的防治任務(wù)顯得尤為艱巨［3，7］.目前在宮頸癌的綜合治療中，除手術(shù)、放療之外，化療是防治該腫瘤的重要手段之一，但由于當(dāng)前的一線化療藥物費(fèi)用昂貴，加之毒副作用大，極大的增加了患者的負(fù)擔(dān)和痛苦.因此，新型的高效、低毒的化療藥物亟待開發(fā).近年來，許多少數(shù)民族地區(qū)流傳使用的草藥以毒性低、安全范圍廣、藥源豐富越來越受到人們的關(guān)注，已成為腫瘤治療領(lǐng)域的一大特色.南赤瓟作為土家族民間草藥，主要用來治療癰腫、腸炎、痢疾、毒蛇咬傷，通乳及婦科疾病.我們前期發(fā)現(xiàn)其水提物和醇提物可顯著誘導(dǎo)Hela和Caski細(xì)胞凋亡［2－3］.本研究擬在此基礎(chǔ)上通過裸鼠宮頸癌Caski移植瘤模型，觀察南赤瓟醇提物對(duì)對(duì)裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的抑制作用，并在此基礎(chǔ)上探尋其可能的機(jī)制，為此我們?cè)O(shè)計(jì)了此實(shí)驗(yàn).研究發(fā)現(xiàn)，南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）可顯著抑制瘤體組織中的腫瘤細(xì)胞增殖，且隨南赤瓟醇提物劑量增加，其瘤體積、瘤重均明顯減小，抑瘤率顯著增大，與模型組比較具有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）.細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞凋亡是評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物的重要依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)通過HE染色和細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠用南赤瓟醇提物治療后，腫瘤組織的形態(tài)學(xué)也發(fā)生改變，出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡及壞死；流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，南赤瓟醇提物可顯著誘導(dǎo)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而且隨著其劑量的增加其作用效果愈加明顯.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南赤瓟醇提物對(duì)裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的生長具有顯著的抑制作用，該作用主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的.

總所周知，細(xì)胞凋亡是生物體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下所發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程，通常情況下，該過程受到生物體信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)密調(diào)控［8－9］.在總舵 的 調(diào) 控 因 素 中，Bcl－2 家 族 最 受 備 受關(guān)注，通常情況下，Bcl－2基因在細(xì)胞凋亡的上游發(fā)揮調(diào)控作用，它通過和Bax結(jié)合形成異源二聚體，來抑制Bax的促凋亡作用；當(dāng)Bax表達(dá)升高時(shí)，由于Bax同源二聚體形成增多，使得細(xì)胞凋亡加速；反之，當(dāng)Bcl－2表達(dá)升高時(shí)，會(huì)加速Bax同源二聚體解離，進(jìn)而形成Bcl－2／Bax異源二聚體，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用，因此Bcl－2／Bax的比值常常決定著細(xì)胞的存活或死亡［3］.本研究中，我們發(fā)現(xiàn)南赤瓟醇提物可顯著地升高Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織中Bax mRNA表達(dá)，降低Bcl－2mRNA表達(dá)和Bcl－2與Bax的比值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南赤瓟醇提物對(duì)裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用可能與其調(diào)節(jié)Bcl－2和Bax基因表達(dá)水平有關(guān).

在細(xì)胞凋亡的調(diào)控通路中，除Bcl－2家族參與細(xì)胞凋亡外，細(xì)胞質(zhì)中的Caspase蛋白激酶家族在這一過程扮演了重要角色［10］.總所周知，在凋亡過程中，Bcl－2家族在細(xì)胞凋亡的上游過程發(fā)揮作用，而Caspase蛋白激酶家族則在下游發(fā)揮作用，在這一過程中有多種促凋亡和抗凋亡的蛋白相互博弈來決定著細(xì)胞命運(yùn).比如，Bcl－2家族基因異常表達(dá)，使得Bcl－2／Bax比值降低，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿中，與凋亡蛋白酶活化因子－1和Caspase－9的前體結(jié)合形成凋亡小體，來激活Caspase－9，再酶解Caspase－3前體，釋放出C末端小肽片段，從而活化Caspase－3，然后瀑布式激活Caspase－2，Caspase6，Caspase8，Caspase10等蛋白激酶.最終激活脫氧核糖核酸酶，水解核酸和細(xì)胞骨架蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［3，11－12］.因此，激活 Caspase－9及Caspase－3是細(xì)胞凋亡的必經(jīng)之路.本研究中，我們發(fā)現(xiàn)南赤瓟醇提物可顯著升高Caski細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織中Caspase－9及Caspase－3的mRNA表達(dá)水平，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與腫瘤組織形態(tài)學(xué)和細(xì)胞凋亡分析結(jié)果一致.

綜上所述，南赤瓟醇提物可顯著抑制裸鼠宮頸癌Caski移植瘤的生長，促進(jìn)瘤體腫瘤細(xì)胞的凋亡，且呈明顯的劑量依賴性，并初步證實(shí)其機(jī)制可能與上調(diào)Bax、Caspase－9、Caspase－3和下調(diào) Bcl－2凋亡相關(guān)的基因表達(dá)有關(guān)..

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