連翹葉多糖對小鼠免疫功能影響的研究

張岫秀，蔡盈，吳中梅，高勇（.徐州市兒童醫院，江蘇徐州22006；2.徐州市醫學科學研究所，江蘇徐州22006）

連翹葉多糖對小鼠免疫功能影響的研究

張岫秀1，蔡盈1，吳中梅1，高勇2，*
（1.徐州市兒童醫院，江蘇徐州221006；2.徐州市醫學科學研究所，江蘇徐州221006）

摘要：研究連翹葉多糖對環磷酰胺（CTX）所致免疫低下模型小鼠的免疫調節功能。采用腹腔注射環磷酰胺制造免疫抑制小鼠模型，考察不同劑量連翹葉多糖對免疫抑制小鼠臟器指數、巨噬細胞吞噬功能、淋巴細胞增殖活性、血清IL-2和IL-4水平、溶血素水平和溶血空斑形成數量的影響。連翹葉多糖能明顯提高環磷酰胺所致免疫抑制小鼠的胸腺指數、脾臟指數、巨噬細胞吞噬能力、脾淋巴細胞的增殖能力、血清中IL-2和IL-4水平、溶血素含量和溶血空斑形成數量。連翹葉多糖具有良好的免疫增強活性，在藥品與功能食品的開發中具有較高的應用價值。

關鍵詞：連翹葉；多糖；免疫功能

連翹（Forsythia suspense）為木犀科植物，是我國一種傳統的中藥材，廣泛分布在河北省太行山地區，主要含有連翹酚、連翹苷、連翹苷元、齊墩果酸、甾醇化合物、醛酮類、醇酯醚類揮發性成分[1]，具有抗菌消炎、清熱解毒、消腫散結、疏散風熱等功效。連翹果實為連翹的主要入藥部位，而大量的連翹葉卻未得到充分利用，大部分被直接廢棄，造成資源浪費。近年來，已有學者對連翹葉片黃酮類、皂苷類等成分進行了研究[2]，而關于連翹葉片多糖類物質的研究卻鮮見報道。多糖一般是由10個及以上單糖以α-糖苷鍵或β-糖苷鍵以不同的方式連接而成的極性大分子化合物，因其具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血脂、免疫調節活性[3-5]而得到廣泛關注和研究。本研究以連翹葉為原料，采用水提醇沉方法制備得到連翹葉粗多糖，研究了該多糖對小鼠免疫功能的影響。

1　試驗材料

環磷酰胺（批號：H14023686）：山西普德藥業股份有限公司；RPMI-1640培養基：上海浩然生物技術有限公司；刀豆素A（ConA）：北京中生瑞泰科技有限公司；噻唑藍（MTT）：北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）：北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素-4（IL-4）試劑盒：美國BD公司；白細胞介素-2（IL-2）試劑盒：美國BD公司；DEAE-Cellulose52：上海純優生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

RE52CS-1旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1B-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；752PC型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；MK3型酶標儀：Thermo Fisher。

連翹葉：購于安徽亳州；雞：健康家雞；豚鼠：健康豚鼠。

2　方法

2.1連翹葉多糖制備與含量測定

水提醇沉法制備連翹葉粗多糖[6]，粗多糖經Sevag法脫除蛋白，采用DEAE-Cellulose52柱層析分離獲得高純度連翹葉多糖。制備連翹葉片干粉，超聲提取兩次，過濾并合并濾液，濃縮，加入4倍體積的無水乙醇，靜置過夜，離心取沉淀，真空干燥，得到連翹葉片粗多糖。粗多糖首先經Sevag法脫除蛋白3次，然后采用DEAE-Cellulose52柱層析分離，分別采用蒸餾水和0.5 mol/L NaCl洗脫，合并洗脫液，濃縮干燥，獲得高純度連翹葉多糖。采用苯酚-硫酸法[7]測定連翹葉片多糖含量。

2.2連翹葉多糖免疫活性測定

2.2.1小鼠造模、分組與給藥

小白鼠（昆明種）購于河北醫科大學動物室，雌雄各半，體重18 g～22 g，正常飼養適應一周，將小鼠隨機分成5組，即正常組、模型組和給藥組（連翹葉多糖高、中、低劑量組），每組10只，雌雄各半，各組體質量無統計學差異。正常組每天灌胃生理鹽水0.3 mL和腹腔注射生理鹽水0.3 mL，模型組每天灌胃生理鹽水0.3 mL和腹腔注射CTX 20 mg/kg。3個給藥組每天分別灌胃0.3 mL不同濃度的連翹葉多糖（高、中、低劑量分別為300、150、75 mg/kg）溶液，同時腹腔注射CTX 20 mg/kg。

2.2.2免疫器官臟器指數的測定[8]

按“2.2.1”方法進行小鼠分組、造模和給藥處理。給藥一周后將小鼠脫頸椎處死，于無菌條件下剝取脾臟、胸腺器官稱重，計算臟器指數，臟器指數按式（1）計算。

臟器指數/（mg/g）=器官質量/體質量（1）

2.2.3腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定[9]

按“2.2.1”方法進行小鼠分組、造模和給藥處理。給藥一周后腹腔注射5%的雞紅細胞0.5 mL進行免疫，10 h后處死，剪開腹部皮膚并用2 mL生理鹽水沖洗腹腔，吸取沖洗液滴于載玻片上，37℃孵育30 min，用生理鹽水漂洗，干燥后用丙酮和甲醇等比例混合溶液固定6 min～10 min，瑞氏染液染色，然后油鏡下觀察并計數，計算巨噬細胞吞噬率及吞噬指數，吞噬率及吞噬指數分別按式（2）和式（3）計算。

2.2.4脾淋巴細胞增殖活性的測定[10]

取“2.2.2”方法所得小鼠脾臟，常規制備脾細胞，用RPMI-1640培養液稀釋至細胞濃度為2×106個/mL，各取400 μL至96孔培養板中，加入200 mg/L ConA溶液10 μL，培養基代替ConA溶液做對照，于37℃、5% CO2培養箱中培養72 h。培養結束前4 h各取上清液200 μL，加入已除菌的5 mg/mL MTT溶液40 μL，繼續培養至結束。離心保留沉淀，各加入37℃DMSO300μL，振蕩10 min，酶標儀測定570 nm處吸光值，計算淋巴細胞增殖指數，淋巴細胞增殖指數按式（4）計算。

式中：A處理為加ConA孔吸光值；A對照為空白孔吸光值。

2.2.5血清中IL-2、IL-4的測定

按“2.2.1”方法進行小鼠分組、造模和給藥處理。給藥一周后各組小鼠摘眼球取血，3 000 r/min離心15 min，取血清，按試劑盒的說明操作，檢測各組小鼠血清中IL-2和IL-4水平。

2.2.6溶血素及溶血空斑形成測定[11]

按“2.2.1”方法進行小鼠分組、造模和給藥處理。給藥第一天，小鼠腹腔注射5%的雞紅細胞0.3 mL進行免疫，末次給藥1 h后摘取眼球取血，離心，取血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清2mL、5%雞紅細胞1 mL和10%新鮮豚鼠血清1 mL，混勻，以生理鹽水代替豚鼠血清做空白對照，37℃保溫30 min，4℃離心，取上清液，于540 nm處測定吸光值，檢測溶血素水平。

小鼠取血致死后，取脾臟并勻漿，用都氏液稀釋至細胞個數為5×109個/mL。取相同體積的脾細胞混懸液、0.2%雞紅細胞和10%新鮮豚鼠血清混勻。以生理鹽水代替豚鼠血清做空白對照，37℃保溫1 h，3 000 r/min離心15 min，取上清液，于413 nm處測定吸光值，檢測溶血空斑數量。

2.3數據處理

數據采用SAS9.1軟件進行統計分析，以平均值±標準差（±SD）表示數值，差異顯著性分析采用單因素方差分析。

3　結果與分析

3.1連翹葉多糖含量測定

多糖含量測定標準曲線：Y=0.006 2x+0.053 7，R2= 0.995。連翹葉片純化多糖的得率為4.12%，多糖含量為90.74%。

3.2連翹葉多糖對免疫抑制小鼠免疫器官指數的影響

不同劑量連翹葉多糖對免疫抑制小鼠胸腺和臟器指數的影響見表1。

由表1可以看出，與正常組相比，模型組小鼠臟器指數均顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，中、高劑量組連翹葉多糖可以顯著增加胸腺重量（P<0.01），高劑量組多糖可以顯著增加脾臟重量（P<0.01）。

3.3連翹葉多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

不同劑量連翹葉多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響見表2。

表2　連翹葉多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（±SD）Table 2　Effect of FLP on abdominal cavity macrophage function in immunosuppressive mice（±SD）

表2　連翹葉多糖對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（±SD）Table 2　Effect of FLP on abdominal cavity macrophage function in immunosuppressive mice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★與模型組比較P<0.05；★★與模型組比較P<0.01；-表示未測定。

組別　　劑量/ （mg/kg）　　吞噬率/%　　吞噬指數正常組　-　41.274±5.778　0.523±0.058模型組　-　29.560±3.695▲▲　0.372±0.049▲▲連翹葉多糖低劑量組　75　32.512±2.666　0.396±0.046連翹葉多糖中劑量組　150　34.168±4.476★　0.412±0.043連翹葉多糖高劑量組　300　39.515±4.268★★　0.493±0.057★★

由表2可以看出，與正常組相比，模型組小鼠巨噬細胞的吞噬功能顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。中、高劑量組連翹葉多糖可顯著提高巨噬細胞的吞噬功能，與模型組相比統計學差異明顯（P< 0.05，P<0.01），高劑量組多糖可顯著提高吞噬指數（P< 0.01），表明連翹葉多糖對免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬功能具有促進作用。

3. 4連翹葉多糖對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

不同劑量連翹葉多糖對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響見表3。

表3　連翹葉多糖對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響（±SD）Table 3　Effect of of FLP on lymphocyte proliferation in immunosuppressive mice

表3　連翹葉多糖對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響（±SD）Table 3　Effect of of FLP on lymphocyte proliferation in immunosuppressive mice

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★與模型組比較P<0.05；-表示未測定。

組別　　劑量/（mg/kg）　　脾淋巴細胞增殖指數正常組　-　87.240±8.201模型組　-　67.347±8.351▲▲連翹葉多糖低劑量組　75　69.672±7.664連翹葉多糖中劑量組　150　72.274±7.011連翹葉多糖高劑量組　300　74.620±6.343★

由表3可以看出，與正常組相比，模型組小鼠脾淋巴細胞的增殖能力顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，高劑量組連翹葉多糖可以顯著增強免疫抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖能力（P< 0.05）。

3.5連翹葉多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4含量的影響

不同劑量連翹葉多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4含量的影響見表4。

表4　連翹葉多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4含量的影響（±SD）Table 4　Effect of FLP on the the leval of IL-2 and IL-4 in immunosuppressive mice（±SD）

表4　連翹葉多糖對免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4含量的影響（±SD）Table 4　Effect of FLP on the the leval of IL-2 and IL-4 in immunosuppressive mice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★★與模型組比較P<0.01；-表示未測定。

組別　　劑量/ （mg/kg）　IL-2（pg/mL）　IL-4（pg/mL）正常組　-　31.388±2.731　35.693±3.819模型組　-　13.045±1.426▲▲　21.937±2.654▲▲連翹葉多糖低劑量組　75　14.859±2.360　23.746±2.018連翹葉多糖中劑量組　150　17.912±2.418★★　26.524±2.097★★連翹葉多糖高劑量組　300　22.358±3.130★★　33.231±3.560★★

由4可以看出，模型組小鼠血清中IL-2和IL-4含量顯著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，中、高劑量組連翹葉多糖可顯著提高免疫抑制小鼠血清中IL-2和IL-4水平（P<0.01）。

3. 6連翹葉多糖對免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響

不同劑量連翹葉多糖對免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響見表5。

表5　連翹葉多糖對免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響（±SD）Table 5　Effect of FLP on the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice（±SD）

表5　連翹葉多糖對免疫抑制小鼠溶血素及溶血空斑形成的影響（±SD）Table 5　Effect of FLP on the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice（±SD）

注：▲▲與正常組比較P<0.01；★★與模型組比較P<0.01；-表示未測定。

溶血空斑A413 nm（n=5）正常組　-　0.543±0.041　0.367±0.037模型組　-　0.212±0.017▲▲　0.191±0.028▲▲連翹葉多糖低劑量組　75　0.234±0.026　0.207±0.024連翹葉多糖中劑量組　150　0.357±0.046★★　0.218±0.034連翹葉多糖高劑量組　300　0.418±0.040★★　0.279±0.031★★組別　　劑量/ （mg/kg）溶血素A540 nm（n=10）

由表5可以看出，與正常組相比，模型組小鼠溶血素水平和溶血空斑形成數量顯著下降（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。與模型組相比，中、高劑量連翹葉多糖能夠明顯促進免疫抑制小鼠溶血素值升高（P< 0.01），高劑量連翹葉多糖能夠明顯增加溶血空斑數量（P<0.01），表明連翹葉多糖對提高免疫抑制小鼠體液免疫功能有一定作用。

4　討論

環磷酰胺是臨床抗腫瘤的基礎藥物，在取得較好療效的同時對機體免疫系統有較大的損傷[13]。本文考察了不同劑量的連翹葉多糖對環磷酰胺導致的免疫功能低下小鼠免疫系統的修復能力。

機體免疫細胞大多分布于主要免疫器官胸腺和脾臟，兩者的重量在一定程度上可反映免疫器官內淋巴細胞的數量，從而反映機體免疫能力的強弱；巨噬細胞是機體非特異性免疫系統的主要組成部分，可吞噬異體抗原，吞噬細胞數量的增加和吞噬能力的增強反映了機體非特異性免疫功能的增強。淋巴細胞增殖實驗常用于評價動物免疫能力的強弱，其增殖率的高低可直接反應機體的T淋巴細胞或B淋巴細胞的免疫水平；IL-2和IL-4是由輔助性淋巴細胞分泌的細胞因子，能促進T、B淋巴細胞增殖、分化和抗體的產生，對機體的細胞免疫和體液免疫功能均有重要的促進作用；溶血素是小鼠血清抗體水平的指標，溶血空斑是抗體形成細胞的檢測指標，血清溶血素含量高低和溶血空斑形成數量，可反映機體體液免疫功能的強弱。

本研究表明適宜劑量的連翹葉多糖能明顯提高環磷酰胺所致免疫抑制小鼠的胸腺指數、脾臟指數、脾淋巴細胞的增殖能力、血清中IL-2和IL-4水平、溶血素水平和溶血空斑形成數量，表明連翹葉多糖具有良好的免疫增強活性，但其免疫調節機制尚不清楚。因此進一步純化連翹葉多糖、研究各組分的免疫活性、各組分的相互作用對免疫活性的影響以及從細胞、分子等層面探討多糖作用機制的工作有待于進一步展開。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.007

收稿日期：2015-10-22

基金項目：徐州市衛生科技資源現狀調查與分析（xkqz030）

作者簡介：張岫秀（1964—），女（漢），副主任護師，學士，主要從事兒科護理與臨床研究。

*通信作者：高勇（1967—），主任技師。

Investigation on the Influence of Polysaccharide from Forsythia suspensa Leaves on Immunological Function of Mice

ZHANG Xiu-xiu1，CAI Ying1，WU Zhong-mei1，GAO Yong2，*
（1.Xuzhou Children's Hospital，Xuzhou 221006，Jiangsu，China；2.Xuzhou Institute of Medical Science，Xuzhou 221006，Jiangsu，China）

Abstract：To investigate the modulation of Forsythia suspensa polysaccharide（FLP）on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide（CTX），mice were injected with CTX to establish the immunosuppressive model.The effects of different doses of FLP on the index of thymus and spleen，peritoneal macrophage activity and the levels of blood serum hemolysin and hemolytic plaque in mice were detected.FLP was effective in improving the immune function of immunosuppressive mice，improved the index of thymus and spleen，increased the phagocytic activity of peritoneal macrophage，proliferation activity of splenic lymphocytes，the level of IL-2 and IL-4 and improved the formation of hemolysin and hemolytic plaque in immunosuppressive mice.FLP could enhance the immunological activity，has a higher application value in the development of immunomodulator and functional foods.

Key words：Forsythia suspensa leaves；polysaccharide；immunological function