河豚魚皮膠原寡肽的毒理學安全性評價

郭洪輝，王安，洪專，*（.國家海洋局第三海洋所，海洋生物資源綜合利用工程技術研究中心，福建廈門36005；.中南大學公共衛生學院衛生毒理學系，湖南長沙40083）

河豚魚皮膠原寡肽的毒理學安全性評價

郭洪輝1，王安2，洪專1，*
（1.國家海洋局第三海洋所，海洋生物資源綜合利用工程技術研究中心，福建廈門361005；2.中南大學公共衛生學院衛生毒理學系，湖南長沙410083）

摘要：以河豚魚皮作為原料，采用兩步酶解法制備河豚魚皮膠原寡肽，分子量分布主要集中在100 u～1 000 u。根據《食品安全性毒理學評價程序和方法》和《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》的要求，利用動物試驗對河豚魚皮膠原寡肽的安全性進行評價。急性經口、經皮毒性試驗選用SD大鼠，大鼠經口LD50＞5 000 mg/kg，經皮LD50均＞2 000 mg/kg；皮膚、眼刺激試驗選擇健康白色家兔，皮膚刺激強度平均分值為0，平均眼刺激積分指數（I.A.O. I）為0，眼刺激平均指數（M.I.O.I）48 h為5。皮膚變態反應（致敏）試驗選用豚鼠，致敏強度為Ⅰ級。

關鍵詞：河豚；膠原寡肽；急性毒性試驗；毒理學；安全性評價

膠原肽是膠原蛋白的水解產物，研究發現，膠原肽具有多種生理調節功能，如改善皮膚水分、促進傷口愈合、抗皮膚老化[1]、抗氧化、抗高血壓[2]、降血脂[3]等，已在化妝品、保健食品、醫藥衛生等領域顯現出良好的應用前景。海洋生物尤其是海洋魚類的皮膚、鱗片及骨正成為膠原肽的新的主要來源[2，4]。近年來，利用魚皮等下腳料，制備出具有各種生理功能的膠原肽已有文獻報道[5-10]，但鮮見有對膠原肽進行毒理學安全性評價報告。本文在以河豚魚皮為原料制備膠原寡肽的基礎上，對其進行毒理學安全性評價，了解膠原寡肽急性經口、經皮的毒性效應，觀察膠原寡肽對眼、皮膚的刺激或腐蝕作用大小以及對皮膚變態反應性，初步估測毒作用的靶器官和可能的毒作用機理，為亞慢性、慢性和其他毒性試驗的劑量設計提供參考，為河豚魚皮膠原寡肽用作護膚用品或保健品的功能性因子的開發方面提供試驗研究基礎。

1　材料與方法

1.1試劑

河豚魚皮：購于福建漳州水產品加工廠；Superdex peptide 10/300GL凝膠分析柱：美國GE公司；魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶（105U/g）、酸性蛋白酶（104U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；蛋白標準物質：美國sigma公司；Epsilon 2-6D凍干機：德國Christ公司。

1.2儀器

30L雙層玻璃反應釜、DFY-20L/20低溫恒溫反應浴：鞏義市予華儀器有限責任公司；Milli-Q超純水純化系統：美國Millipore公司；管式離心機：上海浦東天本離心機有限公司；SG2便攜式pH計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；AKTA全自動蛋白層析系統：美國GE公司。

1.3試驗動物

受試動物購自湖南省天勤生物技術有限公司，試驗動物生產許可證：SCXK（湘）2009-0012號。試驗前常規檢疫1周后，選擇符合要求的動物投入試驗。急性經口、經皮毒性試驗選用SD大鼠，體重為180 g～220 g，雌雄各半；皮膚、眼刺激試驗選擇健康白色家兔，體重2.0 kg～2.5 kg，雌雄各半。皮膚變態反應（致敏）試驗選用豚鼠40只，體重250 g～300 g，雌雄各半。

1.4河豚魚皮膠原寡肽的制備[11]

5 kg河豚魚皮，依次采用酸堿液處理后，洗至中性，加入5 L純水，60℃恒溫加熱攪拌提取2 h后，冷卻至室溫，以管式離心機過濾除渣，得到河豚魚皮的膠原提取液。膠原提取液分別經魚鱗魚皮膠原蛋白水解專用酶和酸性蛋白酶兩次酶解后，得到河豚魚皮膠原寡肽提取液，凍干后為淡黃色的河豚魚皮膠原寡肽粉末。

1.5河豚魚皮膠原寡肽的分子量測定

采用AKTA全自動蛋白層析系統對膠原寡肽的分子量分布進行測定。以50 mmol/L磷酸鹽、0.15mol/L氯化鈉、pH 7.0的緩沖液為流動相，流速0.5 mL/min，進樣量50 μL。圖1為5種標準蛋白的分子量分布圖。

圖1　標準蛋白的分子量分布Fig.1　Molecular weight distribution of standard proteins

采用標準蛋白分子量的對數值對洗脫體積做標準曲線，得到回歸方程：lgMr=-0.246v+6.669 7（R2= 0.995 9），式中：v為洗脫體積；Mr為分子量。通過洗脫體積計算膠原寡肽的分子量分布，并用峰面積歸一法計算不同分子量范圍肽的相對百分比。

1.6成分測定

取河豚魚皮膠原寡肽凍干粉，測定其基本成分。蛋白含量的測定：GB5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》；灰分的測定：GB 5009.4-2010《食品中灰分的測定》；水分的測定：GB 5009.3-2010《食品中水分的測定》。

1.7動物試驗方法[12-13]

1.7.1急性經口毒性試驗

測定最大耐受劑量，按5 000 mg/kg體重染毒。取SD大鼠20只，體重（187.72±3.95）g，雄雌各半，隔夜禁食。取適量受試物用蒸餾水配成所需濃度溶液，一次灌胃給藥，觀察動物給藥后14 d的中毒癥狀及死亡情況。

1.7.2急性經皮毒性試驗

根據預試驗結果，正式試驗測定最大耐受劑量，按2 000 mg/kg體重染毒。取SD大鼠20只，體重（223.53±3.45）g，雌雄各半，給藥前24 h將大鼠背部去毛，面積為4cm×5cm。直接涂敷受試物于去毛區，持續時間為4 h，觀察給藥后14 d的中毒癥狀及死亡情況。

1.7.3急性皮膚刺激試驗

白色家兔4只，雌雄各半，體重（2.5±0.1）kg，試驗前24 h將家兔背部兩側的毛剪去，左右兩側去毛面積均約2 cm×3 cm，以左側為涂藥區，右側為對照區。分別取0.5 g受試物，用少許蒸餾水潤濕涂敷于涂藥區，持續時間為4 h。對照區涂以等量蒸餾水。處理后觀察皮膚刺激反應，觀察期一般不超過14 d。

1.7.4眼刺激試驗

白色家兔4只，雌雄各半，體重2.0 kg～2.5 kg，以左眼為給藥眼，右眼為對照眼。分別取受試物0.1 g，撒入動物左眼結膜囊內，立即輕輕閉合眼瞼約1 min；對照眼給予等量生理鹽水。觀察動物受藥后1、24、48、72 h眼結膜、虹膜和角膜的刺激損傷和恢復情況。

1.7.5皮膚變態反應（致敏）試驗

豚鼠20只，體重250 g～300 g，分為染毒組、陰性對照組和陽性對照組，每組10只，雌雄各半。致敏接觸：試驗前24 h將動物背部左側去毛3 cm×3 cm，分別取受試物0.2 g，用少許蒸餾水潤濕敷貼于去毛區，持續6 h，第7天和14天以同樣方法重復一次；激發接觸：試驗前24 h將動物背部右側去毛2 cm×2 cm，末次致敏后14 d，取受試物0.1 g，用少許蒸餾水潤濕敷貼于去毛區，持續6 h，每日觀察至第12天。陰性對照組僅給予激發接觸。

2　結果與討論

2.1分子量及成分分析

圖2為河豚魚皮膠原寡肽的分子量分布圖。

圖2　河豚魚皮膠原寡肽的分子量分布Fig.2　Molecular weight distribution of collagen peptides from puffer fish skin

從圖2中可以看到，制備的河豚魚皮膠原寡肽的分子量集中分布在100 u～1 000 u之間。經測定，膠原寡肽凍干樣品的蛋白含量為87.3%，灰分為1.1%，水分為3.88%。

2.2安全性試驗

2.2.1急性經口毒性試驗

經口給藥后，河豚魚皮膠原寡肽對SD大鼠急性經口毒性試驗結果如表1所示。

表1 膠原寡肽對SD大鼠急性經口毒性試驗結果Table 1　Results of acute oral toxicity tests of collagen oligoeptide on SD rats

受試大鼠未見異常，在14 d觀察期內受試大鼠無死亡及其它異常，雌、雄性大鼠經口LD50＞5 000 mg/kg（表1）。

2.2.2急性經皮毒性試驗

表2為河豚魚皮膠原寡肽對SD大鼠急性經皮毒性試驗結果。

表2 膠原寡肽對SD大鼠急性經皮毒性試驗結果Table 2　Results of acute dermal toxicity tests of collagen oligoeptide on SD rats

從試驗結果可以看到，經皮給藥后，受試大鼠未見明顯異常，在14 d觀察期內受試大鼠無死亡及其它異常。雌、雄性大鼠經皮LD50均＞2 000 mg/kg（表2）。

2.2.3皮膚刺激試驗結果

給藥4 h后動物涂藥區局部皮膚未見紅斑、水腫。在7 d觀察期內動物均無其他異常現象。皮膚刺激強度平均分值為0，對照區無異常現象。

2.2.4眼刺激試驗結果

給藥后1 h，動物受藥眼未見結膜充血、水腫，無分泌物，觀察至給藥后72 h，受藥眼未見異常。平均眼刺激積分指數（I.A.O.I）為0，眼刺激平均指數（M.I.O.I）48 h為5；對照眼無異常。

2.2.5皮膚變態反應（致敏）試驗

試驗組所有動物局部皮膚均未出現紅斑和水腫，動物皮膚致敏率為0%，致敏強度為Ⅰ級。陽性對照組（2-4-二硝基氯代苯）受試動物皮膚涂藥區可見紅斑、水腫，個別動物出現皮膚潰爛，動物皮膚致敏率為100%，致敏強度為Ⅴ級。陰性對照組動物無異常反應（表3）。

表3　膠原寡肽對豚鼠皮膚致敏試驗結果Table 3　Results of dermal allergy reaction of collagen oligoeptide on guinea pigs

3　結論

以河豚魚皮作為原料，先用酸堿進行預處理后進行提取，再用兩步酶解法制備得到的河豚魚皮膠原寡肽分子量分布主要分布在100 u～1 000 u之間。雖然河豚魚中含有劇毒物質河豚毒素[14]，但是河豚魚皮制備的膠原寡肽急性經口、經皮毒性均屬低毒，雌、雄性大鼠經口LD50＞5 000 mg/kg，雌、雄性大鼠經皮LD50＞2 000 mg/kg；對家兔皮膚、眼睛無刺激性，致敏強度為Ⅰ級。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.044

收稿日期：2014-12-30

基金項目：福建省科技計劃項目（2014N0013）；福建省科技重大專項（2014NZ0001-2）

作者簡介：郭洪輝（1982—），女（漢），助理研究員，博士，主要從事海洋生物資源綜合利用研究。

*通信作者

Toxicology and Safety Evaluation of Collagen Oligopeptide from Puffer Fish Skin

GUO Hong-hui1，WANG An2，HONG Zhuan1，*
（1.Engineering Research Center of Marine Biological Resource Comprehensive Utilization，Third Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，Fujian，China；2.School of Public Health，Central South University，Changsha 410083，Hunan，China）

Abstract：Collagen oligopeptide from puffer fish skin was prepared by two-step enzymatic hydrolysis.The molecular weight of prepared collagen oligopeptide ranged from 100 u to 1000 u.According to the request of “procedures for toxicological assessment of food”and“Chemical irritation，allergic and haemolytic technology guidelines for research”，animal test was utilized for the safety evaluation of collagen oligopeptide from puffer fish skin.Acute oral toxicity test and acute dermal toxicity test indicated that its LD50on SD rats exceeded 5 000 mg/kg and 2 000 mg/kg，respectively.Skin，eye irritation tests were conducted on healthy white rabbits. The mean index of skin irritation and eye irritation（I.A.O.I）on rabbits were 0.The mean index of eye irritation after 48 h was 5.Guinea pigs were used in dermal allergy reaction.The intensity of sensitization wasⅠ.

Key words：puffer；collagen oligopeptide；acute toxicity test；toxicology；safety evaluation