化學發光檢測光子計數的統計特性

陳文洋，鄒明強 ，劉 峰，李錦豐

(1.吉林大學儀器科學與電氣工程學院，吉林長春 130021;2.中檢國研(北京)科技有限公司，北京 100123;3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123)

1 引 言

化學發光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)將具有高靈敏度的化學發光系統與高特異性的免疫反應相結合，用化學發光相關的物質標記抗原或抗體，與待測的抗原或抗體反應后，經過分離游離態的化學放光標記物，加入化學放光系統的其他相關產物產生化學發光，進行抗原或抗體的定量或定性檢測。它是繼放射免疫分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發展起來的一項最新免疫測定技術［1］。

化學發光免疫用發光物作為標記時的靈敏度很高，但是瞬間發光限制了光信號的持續時間。過短的持續時間會導致檢測的結果很不穩定，不具有很好的重現性。現有的研究表明，在化學反應系統中加入增強劑能夠延長發光信號的持續時間至幾十分鐘甚至24 h。同時，傳統的免疫分析又具有特異性。根據這樣的特點，結合傳統的免疫分析與化學發光免疫技術，形成了一種新型的標記免疫分析技術，即增強化學發光免疫分析(Enhanced chemiluminescenceimmunoassay，ECLEIA)。增強化學發光酶聯免疫分析的檢出值最小可達10－15mol/L，其靈敏度比常規的酶免疫分析高3～5個數量級。由于具有靈敏度高、發光量子效率高、使用快速、簡便、應用面廣、化學發光信號持續穩定時間等優點，增強化學發光酶聯免疫分析在免疫分析、蛋白質印跡、核酸檢測等諸多領域得到了廣泛應用［2-12］。目前化學發光免疫分析中使用最多的4種標記物分別是魯米諾、吖啶酯衍生物、異魯米諾及其衍生物、過氧化物酶和堿性磷酸酶，其中魯米諾是開始應用最早、最有效的化學發光物質之一［13］。化學發光是指物質由于吸收了發生化學反應時的化學能，使反應產物分子從基態躍遷至激發態。處于激發態的分子在回到基態時，便會發射出特定波長的光。從統計角度來說，化學發光發射的光子脈沖與化學發光反應組分含量相關［14-16］。化學發光的檢測主要通過光子計數的方式進行。光子計數器作為一種高靈敏度的弱光檢測裝置，其鑒別閾值、光電倍增管高壓等因素對信噪比的影響等已被儀器開發人員進行了大量的研究［17-20］。但是對于檢測對象的光子脈沖發射統計規律對檢測結果的影響的研究還從未見諸報道，而增強化學發光酶聯免疫分析化學發光體系的光子脈沖發射統計過程卻又對檢測結果有重要影響。

本文首次測量了增強魯米諾化學發光體系的光子脈沖統計特性，并根據其脈沖發射時間統計特性對化學發光光子計數檢測裝置的設計進行了數值分析。研究結果表明，增強魯米諾化學發光體系的光子脈沖發射間隔呈Weibull分布。在化學發光反應烈度較低時，脈沖連續發射的可能性增加;而當化學發光反應劇烈時，由于發光效率降低，所以脈沖連續發射的可能性降低，影響化學發光檢測結果的線性，應予以修正。為了保證化學發光的檢測結果具有合理的信噪比，應注意在檢測儀器設計中對光子計數時間做動態調整。

2 光子脈沖統計特性測試方案及實施

2.1 實驗方案

實驗采用辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體(或抗原)，在與反應體系中的待測標本和固相載體發生免疫反應后，形成固相包被-待測抗原-酶(HRP)標記抗體復合物，這時加入魯米諾發光劑、過氧化氫和化學發光增強劑使其產生化學發光。分別配制不同濃度的增強化學發光體系(光子發射頻率不同)。采用示波器記錄不同發射頻率下共3 014個光子脈沖在光子計數裝置中的光電倍增管(PMT)輸出波形及最后輸出的方波信號。根據波形數據統計不同發射頻率下的光子脈沖幅度(PMT輸出信號)、寬度、脈沖間隔(輸出方波信號)的統計規律。

2.2 測量裝置

實驗裝置為自主開發的96通道增強化學發光免疫檢測儀原理樣機，如圖1所示。其中光電倍增管采用濱松公司的CR110光電倍增管，計數器使用ATMEL公司的ATmega8單片機自帶的16位計數器T1(ATmega8晶振頻率8 M)。示波器采用Tektronix DPO3000數字熒光示波器(300 MHz，2.5 G/s，記錄數據長度 5 M)。測試框圖如圖2所示。

圖1 化學發光檢測儀樣機Fig.1 Prototype of Chemiluminescence detector

圖2 光子脈沖測量實驗裝置Fig.2 Experimental device of photon pulse measurement

3 結果與討論

3.1 光子脈沖強度統計特性分析

典型光電倍增管的光脈沖強度分布如圖3所示。各級倍增極熱電子發射的脈沖高度小于光信號的脈沖高度，脈沖數很多;光陰極的熱電子發射及反饋光子的光電激發產生的脈沖高度等于光信號的脈沖高度，脈沖數較少;宇宙射線激發產生的脈沖高度大于光信號的脈沖高度，脈沖數極少。如果采用脈沖高度甄別器對處于高脈沖高度基準(ULD)和低脈沖高度基準(LLD)之間的信號脈沖進行甄別，可實現高信噪比的單光子計數，有利于提高系統的探測靈敏度［21］。

圖3 光子脈沖強度分布與噪聲信號強度分布圖Fig.3 Relationship between the intensity of photon pulse and the intensity of noise signal

圖4 實測光子脈沖強度統計Fig.4 Statistics of actual measurement photon pulse intensity

圖4給出了對觸發計數的3 014個光子脈沖的強度統計，從圖中可以看出超低脈沖得到了很好的抑制，脈沖高度統計不存在明顯的截止，表明實驗系統閾值選取適當。

3.2 化學發光光子計數脈沖寬度統計特性分析

對光子計數器的PMT后信號脈沖的半高全寬進行測量，結果如圖5所示。其統計特性呈現Gaussian分布。采用Gaussian擬合計算PMT后光子脈沖半寬度均值為53.6 ns，標準偏差為6.3 ns，測量數為 3 014。

實驗結果表明，脈沖整形使光子脈沖最后形成的方波脈沖寬度展寬，并且脈沖寬度的差異也增大了，但統計特征仍然呈現Gaussian分布，如圖6所示。Gaussian擬合統計結果均值為89.3 ns，標準偏差為26.5 ns，測量數為3 014。這是由于脈沖整形比較器觸發電平低于脈沖信號強度平均值所致。

圖5 光子脈沖寬度統計Fig.5 Statistics of photon pulse width

圖6 整形后的方波脈沖寬度統計Fig.6 Statistics of the square wave pulse width after shaping

3.3 脈沖間隔與計數頻率之間的統計規律分析

從光子計數脈沖整形原理分析，光子脈沖的脈沖寬度和脈沖幅度與光子脈沖頻率無關，但光子脈沖間隔與光子脈沖頻率(對應化學發光強度)相關。實驗測量了不同光脈沖發射頻率下的脈沖間隔統計分布，數據表明脈沖間隔符合Weibull分布，如圖7所示。

其概率密度函數為［22］:

其中a為尺度參數，b為形狀參數，t為脈沖間隔時間。如果用f(t)和F(t)分別表示概率密度函數和分布函數，則

圖7 光子脈沖間隔統計分布圖Fig.7 Interval statistical distribution map of photon pulse

h(t)為瞬時脈沖發生概率函數。當b=1時，h(t)為常量，此時各種脈沖間隔發生的概率是相等的，也就是滿足指數分布;當b＜1時，h(t)是減函數，隨著距離上一個脈沖發生時間的延長，下一次脈沖發生的概率減小;當b＞1時，h(t)是增函數，隨著距離上一個脈沖發生時間的延長，下一次脈沖發生的概率將增加。

實驗測量了平均脈沖頻率為3 691，7 368，17 692，28 646，33 085 Hz的幾段連續光子脈沖序列的脈沖間隔規律，并根據Weibull分布函數進行了數值擬合，再對所得尺度參數和形狀參數隨化學發光光子脈沖頻率變化關系進行數值擬合，結果如圖8所示。尺寸參數a隨著頻率的增加呈冪級數衰減，表明脈沖平均間距縮小。值得注意的是形狀參數b在化學發光頻率較低的情況下小于1，表明此時脈沖扎堆連續發射的幾率更大，這可能與化學發光反應烈度較低時的局部反應不均勻有關;在高光子脈沖發射頻率情況下，b逐漸接近于1，表明化學發光反應逐漸均勻。

當光子脈沖發射頻率為5～1 000 kHz時，根據擬合公式推算的堆積引起的脈沖漏記結果如圖9所示(假設光子脈沖間距小于2倍光子脈沖寬度，即180 ns時為堆積發生條件)。圖中對比了b=1的情況，也就是光子發射完全與間隔無關的情況下堆積發生的概率。脈沖堆積幾率隨光子脈沖發射率的增加而升高。當光子脈沖發射率較低時，脈沖堆積幾率很低;當光子脈沖頻率達到300 kHz左右時，脈沖堆積幾率已經上升到5%以上。對于實驗所采用的化學魯米諾化學發光反應體系，當化學發光強度增加到100 kHz以上時，化學發光效率開始明顯降低，此時發射光子密度低于理想情況，所以堆積幾率也有所降低。在實際檢測應用中可以根據這一規律對光子計數檢測結果進行校正。

圖8 光子脈沖間隔統計分布圖。(a)尺度參數a隨光子頻率的變化;(b)形狀參數b隨光子脈沖頻率的變化。Fig.8 Interval statistic distribution map of photon pulse.(a)Variation of scale parameter a with the photon frequency.(b)Variation of shape parameter b with photon pulse frequency.

圖9 脈沖堆積與光子脈沖頻率的關系Fig.9 Relationship between the pulse accumulation and photon pulse frequency

3.4 化學發光信噪比與化學發光頻率和計數時間的關系

化學發光檢測信噪比計算公式如下:

式中η為量子效率，R為平均光子流，Rd為暗記數率，t為計數時間。將脈沖堆積引起的計數效率降低引入公式，并計算信噪比隨計數時間和光子脈沖頻率變化的規律，結果如圖10所示。由圖10可知:在相同計數時間情況下，計數頻率越高則信噪比越高;在相同計數頻率情況下，計數時間越長則信噪比越高。

圖10 化學發光信噪比與發光頻率和計數時間的關系Fig.10 Signal to noise ratio of chemiluminescence vs.luminescence frequency and counting time

化學發光檢測的動態范圍較大，樣品不可重復測量。如果設置固定的積分時間，則未知樣品檢測結果的信噪比將存在較大差異。因此，在實際化學發光檢測中可以實時監控化學發光光子脈沖發射頻率，根據圖10結果動態調整積分時間，保證測量結果的信噪比處于一個可以接受的范圍。

4 結 論

光子計數檢測方法結果需要針對化學發光反應的發射光子脈沖的統計特征進行修正。在化學發光檢測應用中，考慮樣品只能單次使用，為了保證將未知檢測樣品檢測結果信噪比控制在一個合理的范圍，應采用動態計數時間方式。總之，對于專用分析儀器的研究除了應考慮檢測過程本身因素的影響，還應針對檢測對象的特征進行分析，以保證儀器具有良好的適用性。

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