葉酸代謝酶基因多態性與反復自然性流產易感性的研究

李曉英 陳麗娟 郭惠萍 強萍

葉酸代謝酶基因多態性與反復自然性流產易感性的研究

李曉英 陳麗娟 郭惠萍 強萍

目的 探討葉酸代謝酶關鍵酶基因多態性與反復自然性流產的易感性。方法 采用基因測序技術檢測60例反復自然性流產和150例正常妊娠的婦女亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR C 677 T、A 1298 C和甲硫氨酸合酶還原酶MTRR A 66 G的基因多態性。結果 流產組MTHFR C 677 T等位基因頻率中T所占比率30.0%（36/120）明顯高于對照組21.3%（64/300）（P＜0.05）；自然性流產組MTHFR A 1298 C基因型頻率中CC所占比率13.3%（8/60）高于對照組3.3%（5/150）（P＜0.05）；等位基因頻率中C所占比率35.8%（43/120）明顯高于對照組24.7%（74/300）（P＜0.05）；MTRR A 66 G基因等位基因頻率中G所占比率33.3%（40/120）明顯高于對照組25.3%（76/300）（P＜0.05）。結論 與正常妊娠的婦女比較，反復自然性流產婦女的MTHFR基因A 1298 C、C677 T兩個位點和MTRR A66 G位點基因的突變基因頻率明顯增加，MTHFR基因和MTRR基因的多態性的檢測可作為反復自然流產患者的臨床診斷指標。

反復自然流產；亞甲基四氫葉酸還原酶；蛋氨酸合成酶還原酶；多態性；易感性

反復自然性流產是指連續發生2次或2次以上的自然流產，是妊娠期常見并發癥之一，發病率為1%～2%，占所有妊娠丟失的15%～20%[1]。目前研究發現，胎盤動脈栓塞所致的胚胎血供不足、絨毛壞死是自然習慣性流產發生的重要原因之一，而高同型半胱氨酸血癥是血液高凝狀態及相關疾病的的獨立危險因素[2-4]。高同型半胱氨酸代謝相關酶基因突變是導致葉酸代謝障礙和高同型半胱氨酸血癥的遺傳性因素，因此，很多學者都將焦點集中在影響葉酸及同型半胱氨酸的代謝、轉運的基因上。研究表明，亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate，MTHFR)及甲硫氨酸合酶還原酶(Methionine synthase reductase，MTRR)基因存在多種基因多態性位點，其中最常見的是MTHFR基因的C 677 T、A 1298 C和MT RR的A 66 G[5]，而這些基因的突變與血清中葉酸、維生素B12及血同型半胱氨酸水平關系密切[6]。本研究旨在探討MTHFR C 677 T、A 1298 C和MTRR A 66 G基因與反復自然性流產的易感性進行。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月～2015年5月張家港市第一人民醫院收治的反復自然性流產非孕期患者60例為本次研究對象。其中，年齡20～36歲，平均年齡（25.3±3.5）歲。所有患者診斷標準符合第8版《婦產科學》[7]有關反復自然性流產的診斷。同時選擇同期150例正常妊娠的婦女作為對照，年齡21～35歲，平均年齡（23.2±4.1）歲。

1.2 方法

1.2.1 試劑與設備 采用Ta q m a n-M G B技術對MTHFR基因C 677 T、A 1298 C和MTRR基因A 66 G位點的單核甘酸多態性（single nucleotide polymorphism,SNP）分型進行檢測。相關儀器、試劑均購自美國ABI公司。反應所用的基因多態位點引物信息見表1。

表1 反應所用的基因多態位點引物信息

1.2.2 樣本DNA提取及葉酸基因分型 樣本DNA采集：提取受檢者的口腔黏膜上皮細胞，利用柱式抽提試劑盒抽提樣本DNA。采用基因測序技術，檢測MTHFR C 677 T、MTHFR A 1298 C和MTRR A 66 G的基因多態性。

1.3 統計學方法 采用統計學SPSS 17.0軟件進行數據處理，計數資料用例數（n）表示，計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR C 677 T基因型頻率和等位基因頻率 自然性流產組MTHFR C 677 T基因型頻率中CT、TT、CC所占比率與對照組比較，差異無統計學意義；等位基因頻率中T所占比率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 2組MTHFR C 677 T基因型頻率和等位基因頻率分布情況［n（%）］

2.2 MTHFR A 1298 C基因型頻率和等位基因頻率 自然性流產組MTHFR A 1298 C基因型頻率中AA、AC所占比率與對照組比較差異無統計學意義，CC所占比率稍高于對照組（P＜0.05）；等位基因頻率中C所占比率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 2組MT HFR A 1298 C基因型頻率和等位基因頻率分布情況［n（%）］

2.3 MTRR A 66 G基因型頻率和等位基因頻率 自然性流產組MTRR A 66 G基因型頻率中AG、GG所占比率、AA所占比率與對照組比較差異無統計學意義；等位基因頻率中G所占比率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 2組MT RR A 66 G基因型頻率和等位基因頻率分布情況［n（%）］

3 討論

葉酸是同型半胱氨酸代謝途徑的一個重要物質，葉酸代謝途徑的正常運轉在維持DNA正常甲基化和DNA從頭合成以及DNA修復中是至關重要的[8]。若控制葉酸代謝的關鍵酶基因突變，其活性將顯著降低，直接影響DNA低甲基化，導致染色體畸變[9]。早在1990年國外學者Libbus等就報道了對倉鼠卵培養中發現缺乏葉酸的培養組的倉鼠染色體畸變率(包括染色體裂隙、染色體斷裂等)是正常倉鼠的10倍[10]。其原因為血漿中有缺陷的葉酸代謝可能會導致DNA合成、參與胚胎形成過程中DNA甲基化受損。且如果體內葉酸缺乏，5-甲基四氫葉酸生成減少，同型半胱氨酸復甲基化通路受阻，體內同型半胱氨酸水平也蓄積升高。所以，出生的缺陷的發生不僅與葉酸缺乏有關，還與同型半胱氨酸升高密切相關。

MTHFR和MTRR是葉酸轉運和代謝過程中關鍵的酶，這些酶基因多態性是過去十多年來的研究熱點，與先兆子癇、胎兒生長受限、死胎、唇腭裂、反復自然流產、胎兒畸形發生等不良孕產結局有關[11-13]。MT HFR基因包括10個內含子和11個外顯子，位于1號染色體短臂，現已發現近二十種基因多態性突變位點，其中以A 1298 C、C 677 T兩個位點的研究最多而備受關注。MTHFR第7個外顯子1298位點腺嘌呤A被胞嘧啶C替代，表現為3種基因型：AA、AC、CC，使得編碼谷氨酰胺轉變為丙氨酸，使酶的活性降低。MT HFR 677位點胞嘧啶C突變成胸腺嘧啶T，表現為三種基因型：CC、CT、TT，基因突變導致在相應位置上MTHFR表達產物發生了改變，由纈氨酸代替了丙氨酸，使酶的活性降低。MT RR基因包括14個內含子和15個外顯子，位于5號染色體短臂，常見的為A 66 G的多態性。MT RR 66位點位于第2外顯子，位點腺嘌呤A突變成鳥嘌呤G后，可引起編碼氨基酸由異亮氨酸變為蛋氨酸。這3個基因多態性位點的基因突變導致葉酸代謝酶活力下降，將導致血漿葉酸和維生素B 12水平降低，血漿同型半胱氨酸水平上升。

馮玲等[14]通過研究葉酸代謝相關基因的多態性與唐氏綜合征的發生關系發現，MTHFR C 677 T突變型等位基因(T)頻率，MTRR A 66 G突變型等位基因(G)頻率在實驗組和對照組差異有統計學意義，CC、TT、GG基因型頻率分布差異有統計學意義(P＜0.05)。MTHFR C 677 T、T 677 T基因型、MTRR G 66 G基因型增加了唐氏綜合征的發生風險，MT HFR C 677 C基因型可能是降低唐氏綜合征發生的保護性因素。Chedraui等[15-16]于2014、2015年2篇研究MTHFR A 1298 C、C 677 T與先兆子癇的發生關系的論文指出，發現攜帶1298 CC純合子突變型和C 677 T多態性的TT突變基因型的孕婦更容易發生先兆子癇。劉念等[17]研究認為，不良孕產的發生與其MTHFR基因C 677 T、A 1298 C位點和MTRR基因A 66 G位點的突變純合型基因頻率的增加有關。本研究結果顯示，自然性流產組MTHFR A 1298 C基因型頻率中CC所占比率高于對照組（P＜0.05）；等位基因頻率中C所占比率明顯高于對照組（P＜0.05）；流產組MTHFR C 677 T等位基因頻率中T所占比率明顯高于對照組（P＜0.05）；MTRR A 66 G基因等位基因頻率中G所占比率明顯高于對照組（P＜0.05），說明MTHFR基因A 1298 C、C 677 T兩個位點和MTRR A 66 G位點基因的突變基因頻率增加與自然性流產有關。分析其原因為葉酸轉運和代謝過程中關鍵的酶MTHFR及MTRR酶位點基因的突變基因頻率增加，導致MTHFR及MTRR酶活性的作用降低，引起血漿高同型半胱氨酸和低葉酸水平，造成同型半胱氨酸在體內蓄積，從而導致自然流產和胚胎發育異常等不良孕產的結局[18]。

總之，與正常妊娠的婦女比較，反復自然性流產婦女的MTHFR基因A 1298 C、C 677 T兩個位點和MTRR A 66 G位點基因的突變基因頻率明顯增加，MTHFR基因和MTRR基因的多態性的檢測可作為反復自然流產患者的臨床診斷指標。

[1] Kurzawiiska G,Seremak-Mrozikiewicz A,Drews K,et al.Genetic conditioned changes in activity of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)and recurrent miscarriages[J].Ginekol Pol,2009,80(10):762-767.

[2] Dekou V,Whincup P,Papacosta O,et al.The effect of the C 677 T and A 1298 C polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene on homocysteine levels in elderly men and women from the Britishregional heart study[J].Atherosclerosis,2001,154(3):659-666.

[3] 宋綠茵，戚潛輝，余達賢，等.同型半胱氨酸代謝相關酶基因多態性與習慣性流產關系的研究[J].中華圍產醫學雜志，2005，8(3):160-164.

[4] 馬玉霞.MTHFR、MTRR基因多態性與人自然流產的相關性研究[D].鄭州：鄭州大學，2011.

[5] Puri M,Kaur L,Walia GK,et al.MTHFR C 677 T polymorphism, folate,vitamin B 12 and homocysteine in recurrent pregnancy losses:a case control study among North Indian women[J].J Perinat Med,2013,41(5):549-554.

[6] 劉英華，陳瑛.葉酸代謝基因與出生缺陷和不良妊娠的關系[J].中國優生與遺傳雜志，2012，28(8):6-8.

[7] 謝幸，茍文麗.婦產科學[M].8版.北京:衛生出版社，2013:127.

[8] 韓旭，王建華，牛勃.DNA修復與神經管畸形的研究進展[J].中國生育健康雜志，2012，23(2):153-154，158.

[9] Liu Z,Wang Z,Li Y,et al.Association of genomic instability,and the methylation status of imprinted genes and mismatch-repair genes,with neural tube defects[J].Eur J Hum Genet,2012,20(5):516-520.

[10] Libbus BL,Borman LS,Ventrone CH,et al.Nutritional folatedeficiency in Chinese hamster ovary cells[J].Chromosomal abnormalities associated with perturbations in nucleic acid precursors[J].Cancer Genet Cytogenet,1990,46(2):231-242.

[11] Govindaiah V,Naushad SM,Prabhakara K,et al.Association of parental hyperhomocysteinemia and C 677 T Methylene tetrahydrofolate reductase(MTHFR)polymorphism with recurrent pregnancy loss[J].Clin Biochem,2009,42(4/5):380-386.

[12] 李曉梅，張友忠，許燕雪，等.MTHFR基因C 677 T位點多態性與不明原因重復性自然流產的相關性[J].中華醫學遺傳學雜志，2004，21（1）：39-42.

[13] 陳惠麗，唐落韻，陳春寶，等.不明原因復發性流產與亞甲基四氫葉酸還原酶及甲硫氨酸合成酶還原酶及甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態性研究[J].中國優生與遺傳雜志，2013，29(6):29-31.

[14] 馮玲，王少帥，喬福元，等.葉酸代謝關鍵酶基因多態性與唐氏綜合征發生關系的研究[J].華中醫學雜志，2006，30(6):445-446，468.

[15] Chedraui P,Andrade ME,Salazar-Pousada D,et al.Polymorphisms of the methylenetetrahydrofolate reductase gene(C 677 T and A 1298 C) in the placenta of pregnancies complicated with preeclampsia[J].Gynecol Endocrinol，2015(2):1-4.

[16] Chedraui P,Salazar-Pousada D,Villao A,et al.Polymorphisms of the methylenetetrahydrofolate reductase gene(C 677 T and A 1298 C) in nulliparous women complicated with preeclampsia[J].Gynecol Endocrinol,2014,30(5):392-396.

[17] 劉念，閻炯，楊林，等.葉酸代謝相關酶基因多態性與不良孕產關系的研究[J].中國計劃生育學雜志，2015，23(5):318-320.

[18] 李茜西，伍萍芝，何琳琳，等.葉酸代謝相關酶基因多態性與不良孕產發生易感性的關系[J].重慶醫學，2015(10):1330-1333.

Objective To investigate the susceptibility between a key enzyme in folate metabolism enzyme and recurrent spontaneous abortion. Methods The genetic polymorphisms of MTHFR C 677 T, MTHFR A 1298 C and MT RR A 66 G in 60 cases of recurrent spontaneous abortion and 150 normal pregnant women were detected using gene sequencing technology. Results MTHFR C 677 T T allele frequency in percentage in natural abortion group 30.0% (36/120) was significantly higher than that in the control group 21.3% (64/300) (P ＜0.05); MTHFR A 1298 C CC genotype frequency percentage in natural abortion group 13.3% (8/60) was higher than that in the control group 3.3% (5/150) (P ＜0.05); C allele frequency percentage 35.8% (43/120) was significantly higher than that in the control group 24.7% (74/300) (P ＜0.05); MTRR A 66 G Allelism G gene frequency percentage in natural abortion group 33.3% (40/120) was significantly higher than that in the control group 25.3% (76/300) (P ＜0.05). Conclusion Compared with normal pregnancy women, MTHFR gene A 1298 C, C 677 T and MTRR A 66 G frequency increased in recurrent spontaneous abortion patients, it can be as recurrent spontaneous abortion patients with clinical diagnostic criteria.

Recurrent spontaneous abortion; Methylenetetrahydrofolate reductase; Methionine synthase reductase; Polymorphism; Susceptibility

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.33.001

江蘇 215600 張家港市第一人民醫院 （李曉英 陳麗娟 郭惠萍 強萍）

陳麗娟 E-mail：zhangying 0308@126.com