中軸型脊柱關節炎血清Dickkopf-1表達及相關性分析

崔銀風 張莉蕓 張改連 許珂 馬丹 郭東強 閆俊榮

中軸型脊柱關節炎血清Dickkopf-1表達及相關性分析

崔銀風 張莉蕓 張改連 許珂 馬丹 郭東強 閆俊榮

目的 通過檢測中軸型脊柱關節炎（ax-SpA）患者血清Dickkopf-1（DKK-1）水平，并進行相關性分析。方法 （1）采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測71例初次就診ax-SpA患者[其中51例強直性脊柱炎（AS）和20例非放射中軸型脊柱關節炎（nr-axSpA）]、疾病對照組34例（其中14例類風濕關節炎、10例骨關節炎和10例痛風患者）和15例健康人，分別檢測血清DKK-1水平；（2）根據HLA-B27表達情況，將ax-SpA患者分為陽性組（48例）和陰性組（23例）；按照修訂紐約放射學骶髂關節炎分級標準，AS患者分為Ⅱ級（16例）、Ⅲ級（12例）和Ⅳ級（23例），比較不同分組血清DKK-1的表達差異；（3）分析血清DKK-1水平與ax-SpA患者臨床指標、炎性指標及影像學評分的相關性。結果 （1）AS患者血清DKK-1水平[（2133.9±432.9）ng/L]高于疾病對照組（RA、OA和Gout患者）和健康人[（1718.7±260.4）ng/L]，差異有統計學意義（P＜0.05）。而低于nr-axSpA患者[（2303.9±289.4）ng/ L]，差異無統計學意義。（2）ax-SpA患者HLA-B27陽性血清DKK-1水平[（2150.47±440.9）ng/L]低于HLA-B27陰性患者[（2418.8±319.5）ng/L]，差異有統計學意義（P＜0.05）。AS患者放射學骶髂關節炎Ⅳ級血清DKK-1水平[（1878.91±285）ng/L]低于Ⅱ級[（2248.18±365.53）ng/L]，差異有統計學意義（P＜0.05），而Ⅲ級血清DKK-1水平分別與Ⅱ級[（2248.18±365.53）ng/L]、Ⅳ級[（1878.91±285）ng/L]比較，差異無統計學意義。（3）血清DKK-1水平與

ax-SpA患者病程(r=-0.424,P=0.0001)、BASMI(r=-0.264,P=-0.026)和AS患者mSASSS評分(r=-0.581,P=0.023)呈負相關，而與ax-SpA患者臨床指標、炎性指標及SPARCC評分無相關性。結論 血清DKK-1水平隨著漸進骨化程度的加重呈下降趨勢，可能是AS發生關節強直和骨贅形成的一個重要因素；血清DKK-1水平可以作為評價AS骨化程度的潛在生物學標志物之一。

強直性脊柱炎；中軸型脊柱關節炎；Dickkopf-1；骶髂關節X線；骶髂關節磁共振成像

中軸型脊柱關節炎（axial spondyloarthropathy，ax-SpA）累及骶髂關節和脊柱為主，包括強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）和非放射中軸型脊柱關節病（non-radiogrphic axial spondyloarthropathy，nr-axSpA）。AS是一種慢性炎性風濕性疾病，疾病進展情況個體差異很大所以尋找預測疾病進展的生物標志物非常必要。其中12% nr-axSpA患者在2年內進展為AS[1]，有學者認為AS和nr-axSpA是一種疾病（ax-SpA）的兩個階段[2]，但一些數據顯示一部分比例的中軸型SpA患者可能永遠不會出現X線骶髂關節炎。有的AS患者在發病短期內就會出現關節融合和脊柱強直，而有些患者長期患病卻未出現骨化現象。漸進性骨化必然導致AS患者致畸致殘，不僅造成勞動力的喪失，而且嚴重影響患者的生活質量。目前AS骨化機制尚未明確，初始階段顯示為骨吸收，成骨的晚期階段則主要由Wnt信號通路轉導調控并介導新骨形成。DKK-1是Wnt信號通路的抑制因子。已有實驗動物研究表明，封閉DKK-1發生骶髂關節強直的現象[3]。DKK-1也參與以骨形成為原型的疾病即AS骨重塑的發病過程中。目前DKK-1與ax-SpA的相關研究較少，為了幫助臨床判斷病情進展提供依據，我們設立了此項研究。本研究探討血清DKK-1在ax-SpA患者的表達以及相關性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2013年5月～2014年1月就診于山西醫學科學院山西大醫院風濕免疫科門診及住院的51例AS患者和20例nr-axSpA患者臨床、實驗室及影像學資料（包括1個月之內的骶髂關節X線和MRI）。由專業放射科及磁共振成像醫師閱片，其中20例AS患者脊柱X線片顯示骨贅形成，行修改Stoke強直性脊柱炎脊柱評分（mSASSS評分）[4]和

42例ax-SpA患者MRI示骶髂關節面骨髓水腫，采用加拿大脊柱關節病研究協會評分（SPARCC評分）[5]，并記錄評分情況。AS診斷符合修訂紐約標準并有放射學骶髂關節炎（至少雙側Ⅱ級或單側Ⅲ級）和nr-axSpA診斷符合ax-SpA的分類標準但無X線骶髂關節炎。納入疾病對照組（14例類風濕關節炎、10例骨關節炎和10例痛風）和健康對照（15例），均在性別、年齡方面差異無統計學意義。51例AS患者和20例nr-axSpA患者，男性所占比例分別為78.4%（40例）和45%（9例），平均年齡分別為（35.68±13.62）歲和（30.85±11.22）歲，平均病程分別為（8.78±7.25）年和（4.49±3.01）年，HLA-B27陽性所占比例分別為74.5%（38例）和50%（10例）。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 收集所有患者和健康者外周靜脈血均為清晨空腹抽取，在4℃下處理血液標本，2h內盡快分離血清。3000轉離心10min，將血清分裝并長期儲存在-80℃冰箱保存，備用。

1.2.2 實驗方法 使用ELISA法檢測所有研究對象血清DKK-1水平，DKK-1試劑盒購自上海源葉生物公司，實驗步驟根據說明書進行。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行統計分析。正態計量資料采用“±s”表示。結果滿足正態分布和方差齊性檢驗，計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗分析，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，計量資料之間相關分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ax-SpA患者與不同關節炎疾病和健康者血清DKK-1表達差異 本研究AS組血清DKK-1水平高于RA組、OA組、Gout組和NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05），而低于nr-axSpA組，差異無統計學意義。見表1。

2.2 ax-SpA患者HLA-B27表達與血清DKK-1水平差異 48例HLA-B27陽性ax-SpA患者和23例HLA-B27陰性患者，HLA-B27陽性患者血清DKK-1水平低于HLA-B27陰性患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 中軸型脊柱關節炎患者與疾病對照組和健康對照組血清±s)

表1 中軸型脊柱關節炎患者與疾病對照組和健康對照組血清±s)

注：與nr-axSpA組比較F=7.146，aP=0.101；與RA組比較F=11.76，aP=0.007；與OA組比較F=3.696，aP=0.009；與Gout組比較F=1.109，aP＜0.0001；與NC組比較F=9.53，aP=0.001

M±SDAS（n=51）nr-axSpA（n=20）RA（n=14）DKK-12133.9±432.9a2303.9±289.41808.7±218.3 M±SDOA(n=10)Gout（n=10）NC（n=15）DKK-11457.3±644.81556.0±357.21718.7±260.4

表2 中軸型脊柱關節炎患者不同HLA-B27表達血清DKK-1水平比較（±s,ng/L）

表2 中軸型脊柱關節炎患者不同HLA-B27表達血清DKK-1水平比較（±s,ng/L）

注：與HLA-B27陰性相比，aP=0.011

實驗室指標例數DKK-1 HLA-B27陽性482150.47±440.9aHLA-B27陰性232418.8±319.5

2.3 AS患者放射學骶髂關節炎與血清DKK-1水平差異 AS患者不同放射學骶髂關節炎分級血清DKK-1水平差異有統計學意義（P＜0.05）。Ⅱ級分別與Ⅳ級比較，差異有統計學意義（P＜0.05），Ⅲ級分別與Ⅱ和Ⅳ級比較差異無統計學意義。見表3。

表3 強有性脊柱炎患者不同X線骶髂關節炎分級血清DKK-1水平比較（ng/L）

2.4 ax-SpA患者血清DKK-1水平與臨床、實驗室及影像學指標相關性分析 71例ax-SpA患者基線時血清DKK-1水平與臨床指標及炎性指標的相關性分析結果顯示：血清DKK-1水平與病程(r=-0.424，P=0.0001)、BASMI(r=-0.264，P=0.026)呈負相關；與年齡、BASDAI、脊柱痛、脊柱炎癥、PGA、夜間痛、BASFI、EI、擴胸度、關節腫脹指數、ESR和CRP無關。見表4。

表4 71例中軸型脊柱關節炎患者基線時血清DKK-1水平與臨床指標相關性分析（ng/L）

基線時血清DKK-1水平與影像學評分相關分析結果顯示：20例AS患者血清DKK-1水平與mSASSS評分呈負相關(r=-0.581，P=0.023)，與42例ax-SpA患者SPARCC評分無關（r=-0.23，P=0.143）。見圖1。

3 討論

本研究檢測了血清DKK-1水平與ax-SpA患者疾病活動、炎癥反應和影像學評分的相關性。血清DKK-1在AS患者體內的表達尚未達成一致結論。研究發現AS患者DKK-1水平高于正常人[6]。而有相反研究發現AS患者血清DKK-1水平低于健康人，認為低水平DKK-1與新骨形成有關[7]。還有研究發現AS患者與正常人血清DKK-1水平無差異[8]。本研究發現AS患者DKK-1水平高于健康人，也高于類風濕關節炎、骨關節炎和痛風患者（P＜0.05），而低于nr-axSpA患者（P＞0.05）。

HLA-B27轉基因大鼠與蛋白多糖BALB/c小鼠模型對比，兩者均發生脊椎融合；與雄性DBA小鼠模型對比，兩者先前均無侵蝕之后均發生外周關節強直性病變二者先前均無侵蝕之后均發生外周關節強直性病變[9-10]。HLA-B27可能參與中軸關節和外周關節強直發生。研究表明血清DKK-1水平HLA-B27陽性患者比HLA-B27陰性患者是減少的，而BASRI-S和mSASSS評分顯著增加[11]。本研究發現ax-SpA患者HLA-B27陽性患者血清DKK-1水平低于HLA-B27陰性患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。支持Heba的研究HLA-B27陽性患者可能DKK-1低表達或是AS患者關節強直和脊柱骨贅形成的另一個病理生理因素。

圖1 DKK-1與 mSASSS評分相關性

Diarra[12]在關節炎動物模型給予一種DKK-1拮抗劑，與對照組相比，表明阻斷DKK-1骨侵蝕可以完全抑制，但有趣的是發現有骨贅形成。Uderhardt等[3]使用TNFtg小鼠探索DKK-1在骶髂關節炎的作用，給予抗DKK-1單克隆抗體的這些小鼠發現骨侵蝕減弱而逐漸出現骶髂關節融合。免疫組化分析顯示，封鎖DKK-1，骶髂關節內β-連環蛋白量高度上調，提示DKK-1抑制導致Wnt信號增強，隨后出現新骨形成。A國內單振興等[13]檢測22例早期AS患者和25例中晚期AS患者血清DKK-1水平，認為中晚期血清DKK-1水平降低于早期患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。骶髂關節炎Ⅳ級與Ⅱ級血清DKK-1水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），Ⅲ級分別與Ⅱ和Ⅳ級比較差異無統計學意義。認為血清DKK-1表達隨著骨化程度加重呈下降趨勢，可能是AS發生關節強直和骨贅形成的一個重要因素。

Korkosz[14]檢測50例AS患者血清DKK-1水平疾病活動組（BASDAI≥4分）高于低疾病活動組（BASDAI＜4分）和健康對照組，兩組在頸椎和腰椎X線上mSASSS評分無差別，認為AS高度疾病活動可能與新骨形成不相關。本研究發現aSpA患者血清DKK-1水平與病程、BASMI呈負相關，與其他指標年齡、BASDAI、脊柱痛、脊柱炎癥、PGA、夜間痛、BASFI、EI、擴胸度和關節腫脹指數無相關性。AA炎癥與骨重塑之間的聯系還未得到充分的解釋。有研究認為AS炎癥與新骨形成之間的關系，認為二者是疾病獨立的過程[15]。有研究認為基線時的炎癥與骨贅形成有關，與炎癥持續存在相比，炎癥已得到控制的病例骨贅形成更常出現于邊緣[16]。Gisela[11]認為Wnt信號通路拮抗劑DKK-1表達與急性時相反應物無關聯。AS患者在接受TNF-α抑制劑治療，CRP值下降與DKK-1水平變化無相關性[17]。本研究檢測血清DKK-1水平與炎癥反應如ESR、CRP及SPARCC評分無關，支持炎癥反應與骨化形成可能并不緊密相關的觀點。

有研究認為AS患者血清DKK-1水平與mSASSS評分無相關性[17]。Heiland等[11]研究65例AS患者，在基線時功能性DKK-1水平在無骨贅形成組高于骨贅形成組，但差異無統計學意義；隨訪了31例無骨贅形成患者2年，無新骨形成的患者DKK-1水平明顯高于有新骨形成的患者，DKK-1與另一個Wnt拮抗劑如硬化蛋白水平呈正相關，與CRP無關，但與脊柱放射學評分（mSASSS）呈負相關。本研究對20例AS患者X線顯示脊柱骨贅形成（mSASSS）評分，發現DKK-1與mSASSS評分呈負相關，可以作為評價AS骨化程度潛在生物學標志物之一。

綜上所述，研究認為血清DKK-1在AS患者異常表達，本研究局限于橫斷面研究，仍需擴大樣本長期隨訪研究。并進一步研究確定是DKK-1或是其他Wnt拮抗劑用于預測新骨形成的進展。另一方面，增強或者恢復AS患者DKK-1的功能，可能下調Wnt信號通路，可開發一種抑制新骨形成的方法，DKK-1在AS的功能作用仍需進一步研究。

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Objective To detect serum levels of DKK-1(Dickkopf-1) in axial spondyloarthropathy (ax-SpA) and correlation analysis. Methods (1) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect 71 cases of patients with initial visiting ax-SpA [including 51 cases of ankylosing spondylitis (AS) and 20 cases of non- radiology axial spondyloarthropathy (nr-axSpA)] and serum levels of DKK-1 in disease control groups (14 cases of RA, 10 patients of OA and 10 cases of gout patients) and 15 cases of healthy control group; (2)According to the expression of HLA-B27,ax-SpA patients were divided into positive group (48 cases) and negative group (23 cases);accordance with the revised New York radiological sacroiliitis grading standards,ax-SpA patients were divided into grade Ⅱ (16 cases), grade Ⅲ (12 cases) and grade Ⅳ (23 cases), comparing to expression differences of serum DKK-1 in different groups; (3)Correlation analysis serum levels of DKK-1 with ax-SpA patients clinical indicators,inflammatory markers and radiographic score. Results (1)Serum levels of DKK-1 in AS patients [(2133.9±432.9)ng/L] higher than disease control groups (including RA, OA and Gout patients) and healthy control group [(1718.7±260.4)ng/L],it has a statistical significance (P＜0.05). But lower than nraxSpA patients [(2303.9±289.4)ng/L], the difference was not statistically significant. (2)Serum DKK-1 levels in ax-SpA patients with HLA-B27 positive below HLA-B27 negative patients [(2150.47±440.9)ng/L], the difference had a statistically significant (P＜0.05). Serum levels of DKK-1 in radiographic sacroiliitis grade Ⅳ patients [(1878.91±285)ng/L] and grade Ⅲ patients [(2059.33±324.26)ng/L], the difference had a statistically significant (P＜0.05), whereas serum levels of DKK-1 with grade Ⅱ [(2248.18±365.53)ng/L] and Ⅲ grade [(2248.18±365.53)ng/L], grade Ⅲ and grade Ⅳ, differences was no statistically significant. (3)Serum levels of DKK-1 with duration (r=-0.424 P=0.0001), BASMI (r=-0.264,P=-0.026) of ax-SpA patients and mSASSS score of AS patients (r=-0.581,P=0.023) were negatively correlated, Serum levels of DKK-1 with ax-SpA patients in clinical indicators,inflammatory markers and SPARCC score was no correlation. Conclusion With the severity of progressive ossification, DKK-1 level downward trend that may be an important factor in the occurrence of ankylosis and osteophyte formation of AS; DKK-1 level as one of potential biological markers that can be evaluated ossification degree of AS.

Ankylosing spondylitis; Axial spondyloarthropathy; Dickkopf-1; Sacroiliitis joint X-ray; MRI

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.5.003

山西 030001 山西醫科大學 （崔銀風） 山西醫學科學院 山西大醫院風濕免疫科 （張莉蕓 張改連 許珂 馬丹） 山西大醫院放射科 （郭東強） 山西大醫院磁共振室（閆俊榮）

張莉蕓 E-mail:zhangly2006@sina.com