潰瘍性結腸炎大鼠腸緊密連接occludin蛋白表達降低及藥物的影響

胡紅衛，熊晶晶，趙 川，遠孟夢，魏 來，劉 梅，黃永坤*，趙亞玲，丁臻博

(昆明醫科大學第一附屬醫院 1.兒科； 2.病理科， 云南 昆明 650032)

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潰瘍性結腸炎大鼠腸緊密連接occludin蛋白表達降低及藥物的影響

胡紅衛1#，熊晶晶1#，趙 川2，遠孟夢1，魏 來1，劉 梅1，黃永坤1*，趙亞玲1，丁臻博1

(昆明醫科大學第一附屬醫院 1.兒科； 2.病理科， 云南 昆明 650032)

炎癥性腸病是慢性且易反復發作的胃腸道病癥，主要包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。Occludin蛋白是腸緊密連接中最重要的蛋白質分子之一，表達上調，可以減少腸上皮受損，保護腸黏膜上皮間的緊密連接蛋白，降低腸道通透性[1]。美沙拉秦因其療效好及不良反應較少而作為潰瘍性結腸炎的一線治療藥，但仍可見其不良反應。蒙脫石散是良好的腸黏膜保護劑，參與腸黏膜的直接修復作用。本研究測定腸緊密連接occludin蛋白，擬評價美沙拉秦和蒙脫石散單獨或聯合治療TNBS/乙醇誘導的潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜變化，以深入認識腸黏膜屏障損傷和修復機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象:50只清潔級SD雄性大鼠，體質量160～180 g，6～8周[昆明醫科大學動物實驗中心(合格證號：SYSK(滇)2011- 0004)]。

1.2 主要試劑:2- 4- 6三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司)，美沙拉秦腸溶片(Losan Pharma.GmbH公司)，蒙脫石散(規格3 g/袋，博福-益普生公司)，RNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒(天根生化公司)；兔抗大鼠occludin抗體(Abcam公司)。

1.3 主要實驗方法

1.3.1 分組及造模:將大鼠隨機分為對照組(A組)、模型組(B組)、美沙拉秦組(C組)、蒙脫石散組(D組)和美沙拉秦聯合蒙脫石散組(E組)，每組n=10。參照文獻[2]造模。造模滿24 h隨機抽取1～2只大鼠行解剖及光電鏡檢查證實造模成功。根據人和大鼠體表面積換算公式予各組相應的藥物劑量，模型組給予0.9%氯化鈉溶液2 mL。

1.3.2 疾病活動指數(DAI)評分:造模滿24 h開始每天觀察并記錄大鼠的精神、體質量和大便情況。

1.3.3 標本采集:治療滿12 d時取病變最明顯處腸組織，一部分行HE染色及免疫組織化學法檢測腸緊密連接occludin蛋白的表達。另一部分行實時熒光定量PCR法檢測腸緊密連接occludin-mRNA的表達。

1.3.4 結腸組織病理學評價:行HE染色的結腸組織于光鏡和電鏡下觀察病理改變。

1.3.5 免疫組織化學染色檢測腸緊密連接蛋白occludin:采用Elivision法檢測腸緊密連接occludin蛋白。高倍鏡下隨機選取3個視野，參照Fromowitz半定量分級方法對組織評分。

1.3.6 實時熒光定量PCR法檢測腸緊密連接蛋白occludin-mRNA，occludin引物序列：上游5′-CGGGCTACCTTATTGAA TGTCC-3′，下游5′-GAGCGAACTGAATGGTCTGATG-3′；按照試劑盒說明進行RNA的提取，反轉錄合成cDNA，取1 μL cDNA用于反應。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 31 s，45個循環數。以大鼠GAPDH為內參，運用2-△△ct法進行計算，每次每個樣本重復3次。

2 結果

2.1 模型建立成功:造模滿24 h，大鼠死亡1只。余大鼠出現體質量下降，腹瀉和黏液血便。DAI評分為2.6～3分。在光鏡和電鏡下造模滿24 h大鼠結腸黏膜層缺血、壞死，潰瘍形成面積大，黏膜下層水腫，腺體結構破壞，杯狀細胞減少。模型建立成功(圖1，2)。

2.2 治療12 d以后免疫組化結果及real time PCR結果

3 討論

Occludin蛋白是第一個被發現的定位于緊密連接的跨膜蛋白， 在腸緊密連接屏障中發揮重要作用。腸occludin蛋白表達的降低是導致腸上皮緊密連接通透性增加的重要機制[3]。在潰瘍性結腸炎模型大鼠中，腸occludin蛋白表達明顯降低。蒙脫石散有直接修復腸黏膜的作用，由此聯合使用美沙拉秦和蒙脫石散治療大鼠潰瘍性結腸炎模型。通過實驗發現聯合用藥使occludin蛋白的表達較單獨使用明顯升高。其可能機制一方面是由于美沙拉秦作為非特異性抗炎藥減弱了相應的炎性因子所激活的免疫反應。但同時美沙拉秦作為抗炎藥單純發揮抑制炎性反應的作用，而不能有效改善腸內觸發炎性反應的微環境。蒙脫石散有效覆蓋在腸黏膜上，發揮直接修復腸黏膜的作用，同時吸附有害毒素，減少抗原物質對細胞膜表面Toll樣受體及NOD樣受體的刺激，抑制NF-κB轉錄因子的活化而下調促炎因子。綜上美沙拉秦聯合蒙脫石散治療UC時，發揮了保護和促進腸黏膜修復的效果。

圖1 對照組和模型組光鏡組織嗜伊紅染色Fig 1 Light microscope HE of control and model group(×80)

圖2 對照組和模型組電鏡的組織結構Fig 2 Electric microscope histological structures of control and model group

groupoccludin-mRNA/(×10-4)occludinproteinA8.97±4.330.72±0.17#B6.79±1.350.26±0.20*C17.64±4.83*#0.40±0.26*D13.74±2.61*#0.34±0.17*E28.76±4.50*#0.78±0.14#

*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with B group.

[1] 張文遠,姜偉煒.白頭翁醇提物對大鼠結腸炎腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白的保護作用[J].世界華人消化雜志,2009,17:3134- 3139.

[2] 孫曉萍,候麗娟,王曉紅,等.大鼠慢性潰瘍性結腸炎模型的建立及操作規范探討[J].天津中醫藥2012,29:270- 273.

[3] Rana AS,Khaldun K,Guo SH,etal.Occludin regulates macromolecule flux across the intestinal epithelial tight junction barrier[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2011,300:G1054-G1064.

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“十二五”云南省特色學科群建設項目(201109)；益普生腹瀉基金(IDF- 2012- 01)

1001-6325(2015)11-1540-02

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*通信作者(corresponding author)：13577097854@163.com

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