慢性高原病大鼠肺組織損傷加重及casepase- 3和相關因子的變化

關 巍，崔金霞，時瑩慶，王 晉，馮喜英，格日力

(1.青海大學 高原醫學研究中心， 青海 西寧 810001； 2.青海大學附屬醫院 呼吸科， 青海 西寧 810001；3.武警青海總隊醫院， 青海 西寧 810000)

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慢性高原病大鼠肺組織損傷加重及casepase- 3和相關因子的變化

關 巍1,2，崔金霞2，時瑩慶2，王 晉3，馮喜英2，格日力1*

(1.青海大學 高原醫學研究中心， 青海 西寧 810001； 2.青海大學附屬醫院 呼吸科， 青海 西寧 810001；3.武警青海總隊醫院， 青海 西寧 810000)

慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)發病機制尚不清楚。有報道CMS患者肺彌散功能下降或通氣和彌散功能均下降[1]。目前對CMS肺組織結構的變化研究很少。本研究觀察CMS大鼠肺組織結構的病理改變、肺組織內半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(casepase- 3)及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)內相關炎性因子的變化。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑:清潔級雄性SD大鼠20只，體質量(148±5.2)g，鼠齡6周 [蘭州大學動物實驗室，合格證號：SCXK(甘)2011- 0001]；casepase- 3多克隆抗體、抗兔二抗和免疫組化試劑盒(上海泛柯實業有限公司)；大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素- 6(IL- 6)和IL- 10 ELISA試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型及分組:將大鼠隨機分為對照組和CMS組，每組10只。對照組飼養于青海大學醫學院動物房，海拔2 260 m；CMS組飼養于青海高原醫學研究中心低壓氧艙，模擬海拔5 500 m，常規喂食，31 d后用于實驗。

1.2.2 標本處理:取腹主動脈血液2 mL，測定血常規。分離氣管，夾閉左主支氣管，插導管至右主支氣管，0.9%氯化鈉溶液灌洗右肺，收集BALF，雙層紗布過濾，離心，上清液-20 ℃冰箱保存，沉淀物涂片，用于細胞計數。左、右心房各開1 cm小口，右房開口插入導管，0.9%氯化鈉溶液以20 cm H2O壓力，10 mL/分鐘的速度滴注至肺葉變白，4%甲醛溶液灌洗雙肺，至肺葉變硬、肺緣銳利，分離右肺制作石蠟切片，HE染色檢查組織學和免疫組化檢測casepase- 3。

1.2.3 標本的測定項目:

1)大鼠肺組織形態定量分析：平均內襯間隔(mean linear intercept，MLI)和肺泡破壞指數(destructive index，DI)：Mshot Digital Imaging System V1.0軟件系統，光學顯微鏡(×100)計數。單個肺泡面積(area of pulmonary alveoli, APA)和單位面積肺泡數(density of pulmonary alveoli, DPA)：江蘇省捷達科技8.0圖像分析系統得出結果。

2)免疫組化法測肺組織casepase- 3：肺組織石蠟切片常規脫蠟至水，按免疫組化試劑盒說明書進行操作。

3)ELISA法測BALF中TNF-α、IL- 6和IL- 10濃度：按ELISA試劑盒說明書進行操作。

4)計數BALF中白細胞及各組分： BALF沉淀物涂片巴氏染色，低倍鏡觀察，行白細胞總數及各組分計數。

2 結果

2.1 血常規比較:CMS組的紅細胞數、血紅蛋白及紅細胞壓積顯著高于對照組(表1)，CMS建模成功。

2.2 光鏡下肺組織病理及MLI、DI、APA和DAP的比較:光鏡下可見CMS組部分肺泡破裂及肺泡腔擴大。CMS組的MLI、DI和APA明顯高于對照組(P<0.001)，DAP明顯低于對照組(P<0.001)(表1)。

2.3 BALF中白細胞計數及TNF-α、IL- 6和IL- 10水平比較: CMS組與對照組相比，BALF中白細胞總數及巨噬細胞比例明顯增高(均P<0.001)，TNF-α、IL- 6顯著增高(均P<0.001)，IL- 10無顯著變化(表2)。

2.4 肺組織casepase- 3表達及陽性率變化:CMS組casepase- 3細胞陽性率(10.75±0.96)%顯著高于對照組(3.79±1.09)% (P<0.001)，casepase- 3陽性在CMS組明顯增加(圖1)。

3 討論

CMS以紅細胞增多及顯著低氧血癥為特征。目前認為環境低氧是CMS 低氧血癥的主要原因。但有報道CMS 患者的肺彌散功能、通氣功能有不同程度的下降[1]。高原紅細胞增多癥患者尸檢發現[2]，肺臟散在性出血，肺毛細血管高度擴張淤血，肺泡壁增厚，彈力纖維增多，增粗，肺泡腔擴大或有間質性水腫，間質小血管彈力纖維明顯增多。

表1 CMS組和對照組血常規和MLI、DI、APA和DAP比較Table 1 The comparison of blood routine test and MLI, DI, APA and DAP in CMS group and control group (±s, n=10)

*P<0.001 compared with control group; RBC.red blood cell; HB.hemoglobin; HCT.hematokrit.

表2 CMS組和對照組BALF中白細胞計數和TNF-α、IL- 6和IL- 10水平比較Table 2 The comparison of white cell count and TNF-α, IL- 6 and IL- 10 in CMS group and control group(±s, n=10)

*P<0.001 compared with control group.

圖1 肺組織casepase- 3 表達Fig 1 Casepase- 3 expression in lung tissue(×400)

本研究發現，大鼠在模擬5 000 m的低壓氧艙30 d后，紅細胞及血紅蛋白明顯增加，肺泡破壞增加，肺泡腔增大，單位面積肺泡數減少。

肺泡巨噬細胞合成、分泌TNF-α、IL- 1、IL- 6和IL- 8等，在肺部防御和疾病發生過程中發揮重要作用[3]。TNF-α促進多形核白細胞的聚集、黏附和滲出，釋放溶酶體酶、 彈性蛋白酶以及活性氧、 超氧離子, 損害肺泡上皮細胞。IL- 6與全身性炎性反應和肺功能的下降程度有直接關系。IL- 10幾乎抑制所有促炎細胞因子的合成與釋放，因而具有抗感染作用?

本研究發現，BALF中白細胞總數、巨噬細胞數量以及TNF-α、IL- 6水平較對照組明顯升高，說明CMS大鼠肺組織炎性反應加重。

有研究顯示肺內皮細胞的凋亡與肺損傷相關[4]。本研究發現，CMS大鼠肺組織內促炎因子及凋亡增加，casepase- 3陽性率增高，肺組織破壞增加，提示CMS肺組織損傷，可能是加重CMS患者低氧的重要因素。

[1] 楊彩玲. 30例高原紅細胞增多癥患者肺功能變化及分析[J]. 高原醫學雜志, 2010, 20: 18- 19

[2] 鄒恂達, 王旺強, 王鹿朝. 高原紅細胞增多癥的病理觀察[J]. 高原醫學雜志, 1994, 2: 29- 32.

[3] Alber A, Howie SE, Wallace WA,etal. The role of macrophages in healing the wounded lung [J]. Int J Exp Pathol, 2012, 93: 243- 251.

[4] Perl M, Chung CS, Perl U,etal. Therapeutic accessibility of casepase- mediated cell death as a key pathomechanism in indirect acute lung injury [J]. Crit Care Med, 2010, 38: 1179- 1186.

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2015- 05- 27

1001-6325(2015)11-1542-02

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*通信作者(corresponding author)：weiguan110@163.com