牛磺熊去氧膽酸減輕TGF-β1誘導的MRC- 5纖維化表型

朱錦東，杜澗超，李 寧，蔣澄宇

(中國醫學科學院 基礎醫學研究所 北京協和醫學院 基礎學院 生物化學與分子生物學系， 北京 100005)

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研究論文

牛磺熊去氧膽酸減輕TGF-β1誘導的MRC- 5纖維化表型

朱錦東，杜澗超，李 寧，蔣澄宇*

(中國醫學科學院 基礎醫學研究所 北京協和醫學院 基礎學院 生物化學與分子生物學系， 北京 100005)

目的研究牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)對肺纖維化防治作用。方法建立轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導的人胚肺成纖維細胞(MRC- 5)肺纖維化細胞模型。用MTS法測定TUDCA的安全實驗劑量后，用實時定量-PCR和Western blot檢測α-平滑肌動蛋白(α-SMA)和纖連蛋白的mRNA和蛋白表達。 結果1)TUDCA對MRC- 5細胞無明顯細胞毒作用。2)TUDCA顯著緩解TGF-β1誘導的α-SMA和纖連蛋白的表達。結論TUDCA可以緩解TGF-β1誘導的肺纖維化表型。

牛磺熊去氧膽酸；肺纖維化；轉化生長因子β1

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是以進行性呼吸困難及肺功能下降為主要臨床表現的慢性彌漫性肺間質病[1]。IPF患者確診后5年生存率僅為20%～40%[2- 3]，而目前尚無有效的IPF防治藥物，亟待新類抗肺纖維化藥物應對IPF的臨床需求。

轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1在肺纖維化進程中起關鍵性作用， 抑制TGF-β1表達如氯喹(chloroquine，CQ)，或阻斷其下游信號通路可有效緩解肺纖維化[4- 5]。近年研究發現，IPF患者肺泡上皮細胞內質網應激(ER stress)明顯增加， 表明內質網應激在IPF進程中發揮重要作用[6]。牛磺熊去氧膽酸 (tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)作為內質網應激抑制劑，可以改善內質網應激參與的多種病理過程[7- 8]。本研究擬通過TGF-β1誘導的肺纖維化細胞模型來探討內質網應激抑制劑TUDCA是否具有抗肺纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚肺成纖維細胞(human fetal lung fibroblast，MRC- 5)(協和細胞資源中心)；MEM/EBSS培養基(HyClone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；TUDCA和氯喹(Sigma-Aldrich公司)；細胞增殖與毒性檢測試劑盒(MTS，Cell titer 96 Aqueous One Solution，Cell Proliferation Assay，Promega公司)；TGF-β1(PeproTech公司)；ABI High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits 和Trizol(Invitrogen公司)；SYBR Green Master Mix(Roche公司)；抗α-平滑肌動蛋白小鼠單克隆抗體和抗纖連蛋白小鼠單克隆抗體(Abcam公司)；抗GAPDH小鼠單克隆抗體(聯科生物公司)等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組：MRC- 5細胞在含有10% FBS、1×105U/L青霉素和100 g/L鏈霉素的MEM/EBSS培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。采用3 μg/L TGF-β1誘導的MRC- 5細胞作為肺纖維化細胞模型。CQ干預肺纖維化細胞模型建立：分別在加入TGF-β1前1 h及后6 h加入CQ(3、10和30 μmol/L)，并于TGF-β1處理后24和48 h時分別收取RNA及蛋白樣本。TUDCA干預肺纖維化模型建立：分別在加入TGF-β1前12、1 h和后3 h及后6 h加入TUDCA(100、300和1 000 μmol/L)，并于TGF-β1處理后48 h收取RNA和蛋白樣本。

1.2.2 TUDCA對MRC- 5細胞毒性檢測：將培養的MRC- 5細胞用培養基重懸成單細胞溶液，并以每孔100 μL體積、1×108個/L細胞種于96孔板，繼續于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。在檢測TUDCA對MRC- 5細胞的毒性時，向96孔板中分別加入100、300、1 000及3 000 μmol/L的TUDCA，對照用同樣體積的PBS替代。給藥后60 h進行MTS檢測：分別向上述預防給藥組細胞和治療給藥組細胞中加入20 μL MTS試劑，在37 ℃孵育1～2 h后，在490 nm下檢測吸光度值。

1.2.3 實時定量PCR： 棄除細胞培養基，用1 mL PBS漂洗兩次后加入1 mL Trizol，吹打混勻，移至1.5 mL離心管中。每管加入200 μL三氯甲烷，充分振蕩，室溫靜置5 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。吸取上層液體500 μL移至新的離心管，加入400 μL預冷異丙醇，顛倒混勻。-20 ℃放置20 min后,4 ℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀后將RNA溶于11 μL的Nuclease-free水中。調RNA濃度至150 mg/L后以20 μL體系做反轉錄(ABI公司High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits)，按說明書操作獲得cDNA。采用實時定量PCR檢測肌成纖維細胞標志物α-平滑肌動蛋白(α-SMA)和纖連蛋白的mRNA表達量(以GAPDH為內參)。所用引物：α-SMA 正向引物：5′-TTCCAGCCATCCTTCATC-3′，α-SMA反向引物：5′-ATTGTTAGCATAGAGGTCCTT-3′； 纖連蛋白正向引物：5′-TGCTCAACAGACAACCAA-3′， 纖連蛋白反向引物：5′-CACCAGGACAGTAGAATCAG-3′；GAPDH 正向引物：5′-CGGAGTAACGGATTTGG TC-3′，GAPDH 反向引物：5′-TGGGTGGAATCATATT GGAACAT-3′，用2-ΔΔCt來計算結果，目的基因與內參的比值來表示目的基因的相對表達水平。

1.2.4 Western blot：棄培養基，加入1 mL PBS 漂洗兩次后，加入75 μL RIPA裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后取上清，BCA法測蛋白濃度。取10 μg蛋白樣本進行8% SDS-PAGE電泳。通過Image J軟件分析條帶密度，并以目的蛋白/內參蛋白的比值代表該目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 氯喹(CQ)對肺纖維化表型的影響

在TGF-β1造模后24 h，不同濃度的CQ對纖維化標志物α-SMA和纖連蛋白的抑制作用較弱；在TGF-β1造模后48 h，10與30 μmol/L CQ組均對TGF-β1誘導的α-SMA和纖連蛋白上調的纖維化表型有明顯的預防(-1 h)(P<0.01)和治療(6 h)(P<0.05)效果，以30 μmol/L CQ預防(-1 h)效果最優(P<0.01)(圖1)。

A.Western blot results; B.statistical analysis of Western blot results; NC.negative control;#P<0.01 compared with NC；*P<0.05,**P<0.01 compared with TGF-β1

圖1 氯喹(CQ)干預TGF-β1誘導的MRC- 5肺纖維化細胞模型中α-SMA 和纖連蛋白表達

Fig 1 Effect of chloroquine (CQ) on the protein expression of α-SMA and fibronectin in TGF-β1-induced MRC- 5 pulmonary fibrosis cells

2.2 TUDCA對MRC- 5細胞毒性檢測

TUDCA僅在3 000 μmol/L時對MRC- 5細胞有明顯的細胞毒作用(P<0.01)，細胞存活率低于對照組50%(圖2)。

*P<0.01 compared with NC圖2 MTS檢測TUDCA對MRC- 5的細胞毒作用Fig 2 Cytotoxicity of TUDCA on MRC- 5 by MTS

2.3 TUDCA對肺纖維化表型的影響

與TGF-β1組相比，100、300與1 000 μmol/L TUDCA對TGF-β1引起的MRC- 5細胞α-SMA mRNA高表達均有明顯的預防(-12 h，-1 h)與治療(3 h，6 h)作用(P<0.01)，以1 000 μmol/L TUDCA的治療效果最為顯著(P<0.01)(圖3)。與TGF-β1處理組相比，100與300 μmol/L TUDCA對TGF-β1引起的纖連蛋白 mRNA高表達均沒有明顯的預防(-12 h，-1 h)與治療(3 h，6 h)作用，而1 000 μmol/L TUDCA對TGF-β1引起的纖連蛋白mRNA高表達在晚期預防(-1 h)與治療(3 h，6 h)中抑制作用顯著(P<0.01)(圖4)。1 000 μmol/L TUDCA對TGF-β1引起的MRC- 5細胞α-SMA及纖連蛋白高表達有明顯的預防(-12 h，-1 h)與治療(3 h，6 h)作用(圖5)。

#P<0.01 compared with NC; *P<0.01 compared with TGF-β1圖3 TUDCA干預TGF-β1誘導的MRC- 5肺纖維化細胞模型中α-SMA mRNA的表達Fig 3 Effect of TUDCA on α-SMA mRNA expression in TGF-β1-induced MRC- 5 pulmonary fibrosis cells

#P<0.01 compared with NC;*P<0.05, **P<0.01 compared with TGF-β1圖4 TUDCA干預TGF-β1誘導的MRC- 5肺纖維化細胞模型中纖連蛋白 mRNA的表達Fig 4 Effect of TUDCA on fibronectin mRNA expression in TGF-β1-induced MRC- 5 pulmonary fibrosis cells

A.Western blot results; B.statistical analysis of Western blot results; #P<0.01 compared with NC; *P<0.05,**P<0.01 compared with TGF-β1

3 討論

IPF的病因及發病機制尚不明確，隨著病情的發展，呼吸困難等癥狀進行性加重，嚴重影響患者的生活質量。目前中國IPF發病率逐年上升，并因其進展快、預后差，致死性極高，患者平均壽命為診斷后的3～5年。IPF臨床治療手段匱乏，尚無預防方法或除肺移植以外的國際公認的有效治療方法。隨著對IPF發病機制的深入解析，臨床上急需從各個病理生理環節干預IPF的防治藥物。除了pirfenidone和nintedanib可以延緩IPF進程外，更期待可以彌補臨床上逆轉肺纖維化藥物的空白。近年研究發現內質網應激參與IPF的進程，IPF患者肺泡上皮細胞內質網應激明顯增強。而TUDCA作為內質網應激的抑制劑早已在臨床上用于治療肝膽系統及2型糖尿病等多種疾病。本研究發現，TUDCA還可以對TGF-β1導致的MRC- 5細胞纖維化標志物α-SMA和纖連蛋白的mRNA和蛋白高表達有明顯預防和治療作用，提示TUDCA具有潛在的抗肺纖維化的藥物應用價值。內質網應激如何介導IPF，TUDCA是否通過調節內質網應激發揮抗肺纖維化的作用機制仍需更多體內、外實驗驗證。因TUDCA已在臨床應用數年，臨床用藥安全性好，不良反應少，其對肺纖維化的防治作用值得進一步深入探討及臨床推廣應用。

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Tauroursodeoxycholic acid alleviates TGF-β1-induced pulmonary fibrosis phenotype in MRC- 5 cells

ZHU Jin-dong, DU Jian-chao, LI Ning, JIANG Cheng-yu*

(Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences &School of Basic Medicine Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)

Objective To investigate the prophylactic and therapeutic effects of tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) on transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-induced fibrosis in MRC- 5 cells. Methods Establish TGF-β1-induced MRC- 5 pulmonary fibrosis model. Determine cytotoxicity of TUDCA on MRC- 5 cells by MTS. Real-time PCR and Western Blot were applied to quantify the expression of fibrosis biomarker α-SMA and fibronectin. Results 1) TUDCA was well tolerated by MRC- 5 cells. 2) TUDCA significantly alleviates the expression of α-SMA and fibronectin induced by TGF-β1 in MRC- 5 cells. Conclusions TUDCA alleviates TGF-β1-induced pulmonary fibrotic phenotype of MRC- 5 cells.

tauroursodeoxycholic acid; pulmonary fibrosis; TGF-β1

2015- 02- 02

2015- 04- 14

公益性行業科研專項(201302017)；協和青年基金資助及中央高校基本科研業務費專項資金(3332013132)

1001-6325(2015)06-0767-05

R34

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*通信作者(corresponding author)：chengyujiang@gmail.com