煙草花葉病毒屬條形碼鑒定方法的建立

張永江++馬榮群++辛言言++黃粵

摘要：煙草花葉病毒屬病毒可侵染多種植物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴重危害。為建立該病毒屬的條形碼鑒定技術(shù)，以該屬22個確定種的標準序列為憑證標本序列，分析其保守區(qū)域，設(shè)計6對候選條形碼引物（Tobamo1-Tobamo6），其擴增片段長度為200～1 240 bp。以田間樣本對引物進行篩選，通過比較各引物的擴增效率、測序成功率、獲得序列的親緣關(guān)系對引物的通用性和物種分辨率進行評價。結(jié)果表明，Tobamo6的通用性最高，擴增率和測序成功率均為100%；物種分辨率良好，獲得序列的種內(nèi)種間變異可有效鑒定實際樣本中的辣椒輕斑駁病毒、煙草花葉病毒、番茄花葉病毒和黃瓜綠斑駁花葉病毒；可作為煙草花葉病毒屬的首選條形碼引物。

關(guān)鍵詞：煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）；條形碼技術(shù)；鑒定

中圖分類號：S463.85 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2624-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.016

Development of Barcoding Technique for Identification of the Genus Tobamovirus

ZHANG Yong-jiang1，MA Rong-qun2，XIN Yan-yan1，HUANG Yue2

（1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100029， China； 2.Qingdao Institute of Agricultural Science Research， Qingdao 266100， Shandong， China）

Abstract： Plant viruses of Tobamovirus can infect many plants and is one of the most devastating threats to agricultural production. To develop barcoding technique for identification of genus Tobamovirus， the standard nucleotide sequences of twenty-two type species used as voucher specimen were analyzed by using the software Omiga 2.0， and six pair candidate barcoding primers Tobamo1-Tobamo6 were designed， which amplified 200～1 240 bp bands. These primers were tested by using field samples. Their universality and species resolution were compared during RT-PCR amplification rate， sequencing success rate and sequence phylogenetic relationship. The results demonstrated that Tobamo6 had the highest universality with 100% PCR amplification rate and sequencing success rate； and better species resolution， which can successfully identify four Tobamovirus viruses including Cucumber green mottle mosaic virus，Pepper mild mottle virus，Tobacco mosaic virus and Tomato mosaic virus from field samples. All this suggested Tobamo6 as the primary barcode for the identification of Tobamovirus viruses.

Key words： Tobamovirus； barcoding technique； identification

煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）為蕪菁黃花葉病毒目（Tymovirales）帚狀病毒科（Virgaviridae）成員；根據(jù)國際病毒分類委員會（International Committeeon Taxonomy of Viruses， ICTV）于2012年發(fā)布的最新病毒分類第九次報告，該病毒屬包含曼陀羅輕斑駁病毒（Brugmansia mild mottle virus， BrMMV）等25個確定種和苘麻黃花葉病毒（Abutilon yellow mosaic virus， AbYMV）、甜椒斑駁病毒（Bell pepper mottle virus， BPMoV）、仙人掌輕斑駁病毒（Cactus mild mottle virus， CMMoV）、黃瓜斑駁病毒（Cucumber mottle virus， CuMoV）、雞蛋果花葉病毒（Maracuja mosaic virus， MarMV）及Tropical soda apple mosaic virus （TSAMV）等6個暫定種[1]。同時，該屬內(nèi)新的病毒種類還有增加的趨勢；而且該屬病毒的寄主范圍相當廣泛，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失；因此，加強對該屬病毒的檢測鑒定具有重要意義[2]。國內(nèi)外采用直接觀測法、電鏡法、生物學(xué)測定法、血清學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測等方法[3]對該屬病毒進行鑒定研究。隨著各地植物種質(zhì)資源的引進和栽培條件的改變，對該屬病毒的檢測鑒定方法也提出了更高的要求。endprint

生物條形碼技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種新的生物物種檢測鑒定技術(shù)，由加拿大Guelph大學(xué)的分類學(xué)家Paul Hebert在2003年首次提出，其在物種標準化鑒定方面的優(yōu)勢已備受關(guān)注[4-6]。該技術(shù)利用基因組中一段通用的標準短序列對物種進行鑒定。目前，動物種類鑒定中廣泛使用的是線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（COI）基因；植物上選定的是葉綠體rbcL和matK基因；真菌學(xué)家則以ITS作為真菌的首選條形碼[7]。在植物病毒方面，尚未有開展生物條形碼技術(shù)的研究，本試驗以煙草花葉病毒屬病毒為研究對象，初步篩選評價適于該屬病毒檢測鑒定的生物條形碼。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：花葉癥狀明顯的西瓜、辣椒、南瓜、番茄、蕓豆、煙草及黃瓜等樣品采自山東省青島市田間，保存于-80 ℃冰箱，用作條形碼引物驗證的樣本。

試劑：RNApure超純總RNA快速提取試劑盒購自原平皓生物公司，Transcriptor cDNA Synth試劑盒購自羅氏公司，PCR master mix為MBI產(chǎn)品，DL2 000分子量標準購自大連寶生物生物工程公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 條形碼引物設(shè)計

以Genbank中煙草花葉病毒屬22個病毒的代表種作為病毒的憑證標本（表1），分析其序列保守區(qū)域，根據(jù)條形碼引物設(shè)計的條件即擴增片段長度、擴增片段種內(nèi)的保守性和種間的變異性設(shè)計候選條形碼引物，具體引物信息見表2。

1.3 總RNA提取與RT-PCR擴增

分別稱取樣品0.1 g，按照總RNA提取試劑盒步驟提取各樣品的總RNA。測定濃度后，以總RNA為模板，按照Transcriptor cDNA Synth試劑盒說明進行第一鏈cDNA合成。以合成的cDNA為模板，分別使用上述引物，根據(jù)PCR master mix產(chǎn)品說明進行PCR擴增，反應(yīng)條件見表2。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后送上海生工生物公司測序。

1.4 測序及數(shù)據(jù)分析

采用Omiga（version 2.0）軟件對測得序列進行校對拼接；利用DNAMAN（version 4.0）軟件，采用Kimura-2-parameter distance （K2P）模型計算各序列的種內(nèi)和種間遺傳距離，評價各條形碼候選片段。

2 結(jié)果與分析

2.1 條形碼引物通用性評價

通過分析ICTV第九次報告中煙草花葉病毒屬確定種的代表序列，根據(jù)引物設(shè)計條件，設(shè)計6對候選條形碼引物。PCR擴增效率是評價條形碼技術(shù)的重要標準。以提取的總RNA為模板進行RT-PCR擴增，驗證6對引物的擴增效率。Tobamo1的效率最低，在所有樣品中均無擴增；Tobamo2、Tobamo3、Tobamo4和Tobamo5的效率次之，只在部分樣品中擴增到預(yù)期大小的產(chǎn)物（電泳結(jié)果未顯示）；Tobamo6的效率最高，為100%，在所有測試樣品中均擴增出一條清晰的約200 bp的條帶（圖1）。

PCR產(chǎn)物的測序成功率是評價條形碼引物的另一個重要標準。6對引物中，Tobamo4、Tobamo5和Tobamo6的測序成功率均為100%（表3）。綜合PCR擴增效率和測序成功率，6對候選條形碼引物中以Tobamo6的效果最好，可將其作為煙草花葉屬病毒檢測鑒定的首選條形碼。

2.2 條形碼引物物種分辨率評價

將煙草花葉病毒屬憑證標本序列和Tobamo6的PCR擴增產(chǎn)物序列構(gòu)建鄰接樹，分析病毒種之間的親緣關(guān)系，確定條碼序列在病毒種類鑒定分類中的效果（圖2）。Tobamo6在辣椒和南瓜樣品中擴增到的4個辣椒輕斑駁病毒分離物（PMMoV-SD1、 -SD3、-SD8、-SD9）與代表分離物-S聚為PMMoV簇；在西瓜中擴增到的黃瓜綠斑駁花葉病毒分離物（CGMMV-SD）與其代表分離物-SH聚為CGMMV簇；在煙草和黃瓜上檢測到的3個煙草花葉病毒分離物（TMV-SD3、-SD4、-SD5）與其代表分離物聚為TMV簇；而番茄和蕓豆上的4個番茄花葉病毒分離物（ToMV-SD1、-SD2、-SD3、-SD4）聚為ToMV簇；同時這4個簇與其他病毒種都明顯區(qū)分開。上述結(jié)果表明，Tobamo6從表現(xiàn)病毒癥狀的不同樣品中獲得的同種病毒分離物的序列在種內(nèi)變異足夠小，可以通過聚類確認為同一個病毒種；并且這些同種病毒分離物與不同病毒種的種間變異足夠大，能夠有效區(qū)分不同的病毒種；說明該對條碼引物在煙草花葉病毒屬中具有良好的物種分辨率。

將測定序列在NCBI中進行序列比對，結(jié)果顯示分別為辣椒輕斑駁病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、煙草花葉病毒和番茄花葉病毒（表4），比對結(jié)果與系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果一致，進一步證明了Tobamo6具有良好的物種分辨率。

3 小結(jié)與討論

煙草花葉病毒屬病毒的寄主范圍非常廣，可侵染的植物達150多個屬，主要是一些草本雙子葉植物，包括蔬菜、花卉和煙草等，給這些作物的種植帶來嚴重危害。國內(nèi)不少學(xué)者分別針對不同的煙草花葉病毒屬病毒進行檢測技術(shù)的研究，羅朝鵬[8]、郭京澤等[9]分別就煙草花葉病毒和辣椒輕斑駁病毒進行了RT-PCR檢測技術(shù)探討。生物條形碼技術(shù)的研究可對煙草花葉病毒屬內(nèi)的所有病毒進行有效的檢測鑒定，該技術(shù)的推廣應(yīng)用將極大提高口岸標本檢測的效率和貨品的通關(guān)速度。

通常在物種識別中長序列比短序列的識別率高，在關(guān)系密切的類群中，增加序列信息能夠增加解析度[10]。然而，當樣本質(zhì)量不高，存在RNA降解情況時，常常難以獲得完整的生物條形碼信息，相對而言，約200 bp的微型生物條形碼的序列更易于擴增獲得。范京安等[11]以果實蠅物種鑒定的虛擬試驗和實體試驗表明，微型生物條形碼鑒定果實蠅物種的準確性與生物條形碼基本一致，均可作為果實蠅物種鑒定的有效依據(jù)。本研究表明，約200 bp的候選片段Tobamo6的擴增效率和測序成功率均明顯優(yōu)于其他長片段的條形碼，可考慮將其作為植物煙草花葉病毒屬病毒檢測的首選條形碼。由于試驗材料的局限，還應(yīng)加大樣本量，進一步檢驗該條形碼在煙草花葉病毒屬其他病毒檢測中的適用性。endprint

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