多粘芽孢桿菌發(fā)酵放大工藝研究

周榮華++崔怡寧++饒犇++廖先清++楊自文

摘要：研究多粘芽孢桿菌的發(fā)酵放大工藝，探索在5t發(fā)酵罐中采用不同溶氧、不同碳源A濃度及不同種類的碳源對(duì)發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，混用碳源B和碳源C可以較好的阻止多粘芽孢桿菌自溶，大部分菌體形成芽孢，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量為5億/mL，這些研究為后面的工業(yè)化生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）；放大；自溶

中圖分類號(hào)：Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2634-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.019

Scale-up Fermentation of Paenibacillus polymyxa

ZHOU Rong-hua1，CUI Yi-ning2，RAO Ben1，LIAO Xian-qing1，YANG Zi-wen1

（1.National Biopesticide Engineering Research Center， Hubei Academy of Agricultural， Wuhan 430064， China；

2.Wuhan High School， Wuhan 430061， China）

Abstract： We studied the scale-up fermentation of Paenibacillus polymyxa. Different dissolved oxygen， different concentration of carbon source A and different types of carbon sources on the impact of fermentation were studied at 5 tons fermenter. The results showed that the carbon B combined with carbon C can well prevent autolysis of Paenibacillus polymyxa and most bacteria can form spores. The number of spores in the fermentation broth was 500 million/mL. All these lay a good foundation for the industrialization.

Key words： Paenibacillus polymyxa； scale-up； autolysis

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢桿菌科（Bacillaceae）類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。多粘類芽孢桿菌細(xì)胞呈桿狀，大小為（0.5～2.5） μm×（1.2～10.0） μm，G+C含量為40%～50%；利用周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，在膨大孢子囊中產(chǎn)生橢圓型芽孢；最適生長(zhǎng)pH為7，最適溫度為28 ℃～30 ℃；兼性厭氧，能分解葡萄糖和其他糖類產(chǎn)酸，有時(shí)產(chǎn)氣，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上無(wú)可溶性色素，應(yīng)用前景廣闊[1]。

多粘類芽孢桿菌能分泌大量的活性物質(zhì)，對(duì)許多細(xì)菌和真菌有抑制活性，能提高植物的抗病能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，并能產(chǎn)生多肽類抗菌物質(zhì)對(duì)植物病原真菌有較好的拮抗活性，是一種較好的生防細(xì)菌。另外，多粘芽孢桿菌還具有多種酶活、抗氧化及抗腫瘤等生物活性。隨著多粘類芽孢桿菌研究的深入，它在工農(nóng)業(yè)領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域、生物學(xué)理論研究方面將有更廣闊的應(yīng)用前景[2，3]。盡管多粘芽孢桿菌有著良好的應(yīng)用前景，但是目前大部分研究主要停留在實(shí)驗(yàn)室階段，市場(chǎng)上的產(chǎn)品并不多見，僅僅有的幾個(gè)產(chǎn)品芽孢數(shù)量也不高，這主要是因?yàn)樵摼陌l(fā)酵放大至生產(chǎn)規(guī)模后過(guò)程較難控制，發(fā)酵水平不穩(wěn)定，并且常常在發(fā)酵末期菌體大量自溶，而不是形成芽孢，這成為了阻礙多粘芽孢桿菌產(chǎn)業(yè)化的重要因素。

為了解決上述問(wèn)題，本研究以分離得到的多粘芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa NR1為研究對(duì)象，研究不同的發(fā)酵放大策略，完成了多粘芽孢桿菌在5 t發(fā)酵罐中的發(fā)酵放大研究，發(fā)酵液芽孢數(shù)為5億/mL，在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)中處于較為領(lǐng)先地位。

1 材料與方法

1.1 菌株

多粘芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa NR1為自行篩選得到。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基 在1 000 mL去離子水中加入質(zhì)量體積比為2.0%葡萄糖、2.0%蛋白胨、2.0%酵母浸粉，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 初始發(fā)酵培養(yǎng)基 在1 000 mL去離子水中加入質(zhì)量體積比為2.5%碳源A、2.0%豆粕、1.0%蛋白胨、1.0%酵母粉、0.5%碳酸鈣、pH 6.5～7.0，121 ℃滅菌15 min。

1.3 5t發(fā)酵罐發(fā)酵放大研究

從斜面上接種一環(huán)菌入搖瓶種子培養(yǎng)基中，28 ℃，200 rpm/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期，以5%接種量接入5t發(fā)酵罐，裝料3t，罐壓0.02 MPa，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)整空氣流量對(duì)溶氧進(jìn)行控制，因加入了碳酸鈣，故pH不予控制。

1.4 發(fā)酵放大策略研究

1.4.1 不同溶氧下發(fā)酵放大 將流量分別設(shè)置在20、40、60、80、100 m3/h下進(jìn)行多粘芽孢桿菌的發(fā)酵，發(fā)酵40 h，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鏡檢和芽孢計(jì)數(shù)。

1.4.2 不同濃度碳源A發(fā)酵放大 基礎(chǔ)發(fā)酵液里面分別添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的碳源A，空氣流量設(shè)置為80 m3/h，發(fā)酵40 h，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鏡檢和芽孢計(jì)數(shù)。endprint

1.4.3 不同碳源發(fā)酵放大 基礎(chǔ)發(fā)酵液里的其他成分不變，分別使用2.0%的碳源A、碳源B、碳源C、1.0%碳源A+1.0%碳源C及1.0%碳源B+1.0%碳源C，空氣流量設(shè)置為80 m3/h，發(fā)酵40 h，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鏡檢和芽孢計(jì)數(shù)。

1.5 分析方法

1.5.1 溶氧測(cè)定 梅特勒溶氧電極在線測(cè)定。

1.5.2 芽孢數(shù)測(cè)定 活菌數(shù)按常規(guī)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定[4]，檢測(cè)芽孢數(shù)前，將菌液在80 ℃預(yù)處理20 min，再按照常規(guī)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定[5，6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶氧下發(fā)酵放大結(jié)果

根據(jù)前期200 L發(fā)酵罐研究結(jié)果，當(dāng)空氣流量較大時(shí)，超過(guò)0.6 vvm的時(shí)候，多粘芽孢桿菌會(huì)過(guò)度生長(zhǎng)，從而在發(fā)酵末期多粘芽孢桿菌的菌體會(huì)全部自溶，鑒于此，將空氣流量設(shè)定為不超過(guò)100 m3/h。嘗試5種不同的空氣流量，即20、40、60、80、100 m3/h，發(fā)酵結(jié)束后涂片觀察并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。由表1可知，盡管調(diào)低空氣流量能在一定程度上降低多粘芽孢桿菌自溶頻率和提高芽孢形成率，但是即使將流量設(shè)定在了20 m3/h，最終發(fā)酵液中的菌體大部分發(fā)生自溶，只形成了少量的芽孢，表明單純的降低空氣流量并不能提高芽孢形成率。

2.2 不同濃度碳源A下的發(fā)酵放大

低通氣量并不能阻止多粘芽孢桿菌的過(guò)度生長(zhǎng)和其在發(fā)酵后期的自溶，在此考慮調(diào)整碳源A的使用量，探索此方法能否降低多粘芽孢桿菌的比生長(zhǎng)速率，促進(jìn)芽孢的生成，分別嘗試4種不同碳源A添加量，即1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，發(fā)酵結(jié)束后涂片觀察并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見表2。由表2可知，改變碳源A使用量無(wú)法提高芽孢形成率，反而絕大部分都自溶了，表明碳源A用量不是影響多粘芽孢桿菌形成的關(guān)鍵因素，無(wú)法通過(guò)該方法獲得合格的多粘芽孢桿菌產(chǎn)品。

2.3 不同碳源的發(fā)酵放大

通過(guò)調(diào)整碳源A的使用量并不能提高多粘芽孢桿菌的芽孢形成率，可能因?yàn)樘荚碅作為一種發(fā)酵型碳源，極易被多粘芽孢桿菌利用，即使減少其添加量也無(wú)法降低多粘芽孢桿菌的比生長(zhǎng)速率?？紤]使用遲效碳源B和碳源C，部分或者全部代替碳源A，考察其使用對(duì)于多粘芽孢桿菌形成芽孢的影響。分別使用2.0%的碳源A、碳源B、碳源C、1.0%碳源A+1.0%碳源C和1.0%碳源B+1.0%碳源C，發(fā)酵結(jié)束后涂片觀察并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行計(jì)數(shù)。由表3可知，將碳源B和碳源C混用可以獲得良好的效果，該培養(yǎng)條件下多粘芽孢桿菌能形成大部分的芽孢，數(shù)量為5億/mL。

3 小結(jié)與討論

多粘芽孢桿菌是一種良好的生防促生菌，具有較好的市場(chǎng)前景和極高的應(yīng)用價(jià)值，但是市場(chǎng)上的產(chǎn)品并不多見，主要是其發(fā)酵放大較為困難。本研究探討了多種發(fā)酵策略對(duì)于多粘芽孢桿菌發(fā)酵放大的影響，發(fā)現(xiàn)混用碳源B和碳源C可以較好地阻止多粘芽孢桿菌自溶，大部分菌體形成芽孢，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量為5億/mL，這些研究為后面的工業(yè)化生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)。

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