煙草新型胱硫醚—γ—合成酶的檢測與分析

羅岸

摘要：利用少量細胞分離技術和RT-PCR技術，在煙草合子中克隆到一種新型胱硫醚-γ-合成酶基因，命名為NtCGS-4。序列分析顯示新基因開放性閱讀框長度為1 611 bp，編碼537個氨基酸，預測分子質量為57.931 2 ku，等電點為6.15。利用染色體步移技術獲得該基因5′上游2 696 bp的側翼序列（啟動子和5′UTR）。系統進化分析表明，該基因與多種農作物的胱硫醚-γ-合成酶基因具有較高同源性。煙草新型胱硫醚-γ-合成酶NtCGS-4可能在煙草早期胚胎發生中參與甲硫氨酸的生物合成和代謝。

關鍵詞：煙草；胱硫醚-γ-合成酶；基因克隆；甲硫氨酸；合子

中圖分類號：S572；Q781 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2651-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.024

Detection and Analysis of a New Type of Cystathionine-γ-synthase in Nicotiana tabacum

LUO An

（College of Life Sciences， Yangtze University， Jingzhou 434023， Hubei， China）

Abstract： By application of the reverse transcription PCR（RT-PCR） in small amount of cells，a new type cystathionine-γ-synthase （CGS） gene was found in tobacco zygote，named as NtCGS-4.The analysis showed that the CDS sequence of NtCGS-4 was 1 611 bp，encoding a polypeptide of 537 amino acid residues with a predicted molecular weight of 57.931 2 ku and the theoretical PI was 6.15. 2 696 bp sequence of the 5′ flanking region（promoter and 5′UTR） of NtCGS-4 was obtained by genome walking.The phylogenetic tree revealed that NtCGS-4 had a high homology with CGS gene from multiple crops. The new type cystathionine-γ-synthase（CGS） gene NtCGS-4 may be involved in the biosynthesis and metabolism of methionine in early embryogenesis of tobacco.

Key words： tobacco； cystathionine-γ-synthase； gene cloning； methionine； zygote

含有硫元素的甲硫氨酸屬于人類和家畜的必需氨基酸之一，其含量與農作物的營養價值息息相關[1]。此外甲硫氨酸除了參與蛋白質組成和mRNA翻譯起始外，還能通過一些代謝產物間接調控許多細胞生命活動，比如參與細胞分裂、細胞壁形成、葉綠體和細胞膜合成[2]，參與調控成熟和衰老等過程[3，4]，參與體內平衡和基因表達[5]，以及參與對病菌和昆蟲的防御等[6，7]。

胱硫醚-γ-合成酶（CGS）是甲硫氨酸生物合成途徑中的一個關鍵酶，其表達受到底物的反饋抑制。嚴密精確的調控對于植物胱硫醚-γ-合成酶的表達來說非常重要。擬南芥中胱硫醚-γ-合成酶的下調會導致嚴重的生長延遲現象，影響植物的頂端優勢和花器官的發育，此外也會明顯降低葉綠體的含量[8，9]。而在擬南芥、馬鈴薯、番茄中過量的胱硫醚-γ-合成酶引起的過高的甲硫氨酸含量同樣會導致這些植物不正常的表型[10-11]。

目前對植物中參與甲硫氨酸代謝的調控因子的研究主要集中在營養組織中，在種子中的研究則很少。為此，利用NCBI的數據庫獲得已知的煙草胱硫醚-γ-合成酶基因的序列信息，以此設計引物檢測到在煙草合子中存在一種新型胱硫醚-γ-合成酶基因NtCGS-4的表達。并通過染色體步移技術獲得了NtCGS-4基因的5′側翼序列（啟動子和5′UTR）。新獲得的在煙草早期胚胎發生中表達的新型胱硫醚-γ-合成酶基因為進一步研究甲硫氨酸在植物種子發育中的生物學功能和調控機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗材料為野生型煙草（Nicotiana tabacum var. SR1），種植于長江大學生命科學學院所屬溫室內，室溫25 ℃，光照周期16 h/8 h。

1.1.2 主要試劑和質粒 普通DNA片段回收試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，質粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司），DNeasy Plant Mini Kit試劑盒（QIAGEN公司），Universal GenomeWalker Kit試劑盒（Clontech公司），Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit 試劑盒（Life technologies公司），反轉錄酶SuperScripIII（Life technologies公司），DNA聚合酶Ex Taq（Takara公司），DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB公司），pGEM-T Easy vector（Promega公司），大腸桿菌DH5α感受態細胞為實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 煙草合子的分離 取人工授粉后96 h左右的SR1的胚珠用于合子分離，方法參照文獻[12]。將分離的合子收集至預先加入5 μL 2×Lysis/ Binding Buffer的PCR管中，管內最終總體積不超過10 μL，-80 ℃冰箱保存。同時挑選部分合子以FDA（Fluorescein Diacetate）染色檢測活性，并使用Cooled CCD采集圖像。

1.2.2 合子cDNA的制作和基因片段的獲取 按照Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit試劑盒的要求提取合子的mRNA，并使用Superscript III反轉錄酶合成cDNA第一鏈。使用Primer Premier 5軟件在NCBI提供的胱硫醚-γ-合成酶基因（KJ001150）序列兩端設計檢測引物（表1）進行PCR反應，（98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，39個循環；72 ℃延伸5 min，于4 ℃保溫，Pushion高保真酶擴增）。凝膠檢測并測序。

1.2.3 NtCGS-4基因5′側翼序列的克隆 按照Universal GenomeWalker Kit試劑盒制作walking文庫，并按照要求設計GSP引物（表2）。反應體系和反應條件參照試劑盒要求，引物退火溫度靈活掌握。經過三輪擴增后序列無法繼續延伸，將序列拼接后進行檢測。

1.2.4 生物信息學分析 利用ExPASy（http：//web.expasy.org）的Protparam預測蛋白質的氨基酸組成和理論等電點。利用NCBI的blastx搜索NtCGS-4蛋白的同源氨基酸序列，利用軟件Clustalx 1.83進行同源比對，并用MEGA 4構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 分離煙草SR1的合子

利用酶解和玻璃棒擠壓能有效分離出授粉后96 h的SR1胚珠的胚囊，為了獲得干凈無母體組織污染的合子，則必須進行二次酶解才能將其徹底從胚囊中分離。從圖1可以看出，分離后的合子背景干凈，形態正常，沒有破裂。FDA是熒光素雙醋酸酯，本身并無熒光，其進入細胞內后便產生熒光素。由于FDA不能自由進入細胞膜，所以有活力的細胞才能發出熒光。用FDA分離的合子進行染色發現其熒光強烈，這說明分離的合子狀態良好，具有較好的活性，可以用于下一步的mRNA的提取。

2.2 合子cDNA中胱硫醚-γ-合成酶基因的檢測

利用NCBI查詢到煙草胱硫醚-γ-合成酶基因（KJ001150）的cDNA序列有1 882 bp，含有一個1 620 bp的開放閱讀框。分析序列發現該基因含有一個SSR多態性位點（GCC7）。利用Primer Premier 5引物設計軟件在序列兩端設計檢測引物（表1），用成功提取的合子cDNA進行PCR擴增。擴增結果顯示，在合子cDNA中有預期的1.6 kb左右的條帶出現（圖2），回收測序顯示確是煙草胱硫醚-γ-合成酶基因片段。結果表明在受精后不久的煙草SR1的合子中的確有甲硫氨酸的合成。

需要特別指出的是測序發現PCR產物長度為1 677 bp，其中有一種新型序列與煙草胱硫醚-γ-合成酶基因（KJ001150）的相似度在98%，主要在SSR位點有差異。因NCBI數據庫中已存在3種煙草胱硫醚-γ-合成酶基因，故將新發現的基因命名為NtCGS-4，其SSR位點為（GCC3），擁有胱硫醚γ-合成酶的保守功能結構域（圖3）。這與煙草基因組是異源四倍體，且多態性位點較為豐富的特點相符。

2.3 NtCGS-4基因5′側翼序列的克隆

按照擴增得到的NtCGS-4基因的cDNA序列設計引物，直接使用染色體步移技術來獲取NtCGS-4基因的5′側翼序列。第一輪擴增得到的延伸片段，與“2.2”中擴增得到的NtCGS-4基因的序列拼接后，設計檢測引物在基因組上進行檢測。結果證實NtCGS-4基因在圖3所示片段的基礎上向5′方向延伸了1 537 bp。利用本實驗室煙草基因組數據庫進行Blast比對，發現有一段787 bp的片段能夠與NtCGS-4基因的5′新增序列拼接成功，其中有282 bp完全重合。繼續在此基礎上又進行了兩輪染色體步移，分別新增NtCGS-4基因5′側翼序列161 bp和511 bp。至此將所有新增序列和“2.2”中擴增的序列拼接后分析發現，NtCGS-4基因的CDS的起始密碼子ATG之前共存在2 696 bp的側翼序列，包括啟動子和5′UTR。拼接序列經基因組檢測符合預期（圖4）。

2.4 NtCGS-4蛋白理化性質

使用在線的Protparam工具對NtCGS-4基因編碼的蛋白序列進行生物信息學分析，結果見表3。從表3可以看出，NtCGS-4蛋白由537個氨基酸組成，包含全部20種基本氨基酸類型，分子質量57.931 2 ku，pI為6.15，屬酸性蛋白。該蛋白的正、負電荷殘基分別為47、54個，脂肪系數95.74，不穩定性指數37.68，分析還顯示NtCGS-4蛋白的平均總疏水性為0.078。

2.5 NtCGS-4蛋白氨基酸序列的同源比對和系統進化分析

利用Blastx搜索煙草胱硫醚-γ-合成酶的同源序列，發現在番茄、馬鈴薯、歐洲油菜、水稻、玉米等農作物以及擬南芥中都存在與之類似的蛋白序列。其中煙草本身已有3種胱硫醚-γ-合成酶基因。以煙草NtCGS-4蛋白為例，其與煙草中其他3種胱硫醚-γ-合成酶以及不同物種之間的胱硫醚-γ-合成酶的同源性都很高，氨基酸序列相似度均達到80%以上。對不同物種中胱硫醚-γ-合成酶的氨基酸序列進行比對，發現這些序列的C端都擁有一段極其保守的功能區段。但是在此區段以外，不同物種間的序列差別較大，說明這些區域進化速度較快。選取不同物種的胱硫醚-γ-合成酶序列構建系統進化樹，發現同屬茄科的番茄、馬鈴薯和煙草屬于同一分支，十字花科的歐洲油菜和擬南芥屬于同一分支，單子葉植物水稻、玉米則親緣關系較近（圖5）。值得注意的是，煙草和馬鈴薯各有-種胱硫醚-γ-合成酶與自身的其他胱硫醚-γ-合成酶親緣關系較遠，顯示了胱硫醚-γ-合成酶的進化途徑的多樣化。

3 小結與討論

植物中的甲硫氨酸是動物和人類重要的食物來源，但是甲硫氨酸在大多數的谷類植物中含量非常低。傳統的植物培育方法在提高作物甲硫氨酸水平上的作用不太明顯。現在依靠轉基因技術手段在一些情況下能大幅提高作物的甲硫氨酸含量。但是轉基因植株有時也會表現出不正常的表型，比如生長嚴重延遲，葉子結構發生變化，塊莖產量下降40%～60%，塊莖的顏色發生變化[11]。

植物種子發育起源于合子，合子經過多次分裂與分化最終形成成熟胚胎，因此胚胎發育對于植物種子的正常形成十分重要。但關于甲硫氨酸在早期胚胎發生中的合成與代謝的認識還非常有限。本研究克隆了一個在煙草合子中表達的新型胱硫醚-γ-合成酶基因，并通過染色體步移技術獲取了其5′端側翼序列。這為進一步了解甲硫氨酸在煙草早期胚胎發生中的合成與代謝機制打下基礎。許多農作物的可利用部位是種子，本研究可為培育擁有高含量甲硫氨酸，且種子形態變化小的農作物提供幫助。

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