不同分子標記在菠蘿中檢測效率的比較

王健勝 賀軍虎 陳華蕊 陳業淵

摘要：以來自不同國家的47份菠蘿[Ananas comosus （L.） Merr]種質為材料，對ISSR、SSR、SCoT和RAPD 4種標記在菠蘿基因組中的檢測效率進行了比較。結果表明，不同分子標記檢測效率差異較大，引物篩選率以RAPD最高，達到了47.06%；擴增總條帶數和多態性條帶數均以ISSR最高，分別為238條和222條；而多態性條帶百分比最高的是SSR，達到了92.88%；在有效等位基因數（Ne）、Neis基因多樣性指數（H）、Shannons信息指數（I）和多態性信息含量（PIC）方面，SCoT和SSR綜合表現要優于其他標記。

關鍵詞：菠蘿[Ananas comosus （L.） Merr]；分子標記；檢測效率

中圖分類號：S668.3；Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2676-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.031

Comparison on the Detection Efficiency of Different Types of

Molecular Markers in Pineapple

WANG Jian-sheng1，HE Jun-hu2，CHEN Hua-rui2，CHEN Ye-yuan2

（1. Pingdingshan University， Pingdingshan 467000， Henan， China；

2. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737， Hainan， China）

Abstract： Taking forty seven pineapple germplasms originated from the different countries as material， the detection efficiency in pineapple genome was compared for four types of molecular marker including ISSR，SSR，SCoT and RAPD. Results showed that there was the great difference among the different types of molecular markers. The higher ratio of primer screening was found for RAPD with 47.06%； The greater number of total producing bands and polymorphic bands was all detected for ISSR with 238 and 222，respectively； SSR had the higher percentage of polymorphic bands to the total bands，and its percentage of polymorphic bands reach to 92.88%. For the effective allele number， Neis gene diversity index，Shannons information index and polymorphism information content，SCoT and SSR performed better than other molecular markers.

Key words： pineapple[Ananas comosus （L.） Merr]； molecular marker； detection efficiency

菠蘿[Ananas comosus （L.） Merr]屬鳳梨科鳳梨屬，原產于南美洲，是一種重要的多年生常綠草本果樹，與香蕉、芒果、椰子合稱世界四大熱帶水果。近年來，隨著世界菠蘿需求量的大幅增加以及菠蘿產業的快速發展，越來越多的國家開始重視對菠蘿的基礎研究。分子標記作為一種穩定、高效、便利的研究技術在許多植物研究中已得到了廣泛的應用。與其他主要農作物相比，分子標記應用于菠蘿的研究相對較晚，雖然如此，利用不同分子標記國內外學者針對菠蘿也作了一些初步較好的研究。目前，包括AFLP[1，2]、RFLP[3]、RAPD[4]、SSR[5]、SCoT[6]和SRAP[7]等多種分子標記已被較好地應用于菠蘿研究中。

由于不同分子標記的設計特性決定了其在菠蘿基因組中具有不同的檢測效率，而比較不同分子標記的檢測效率對菠蘿研究中分子標記方法的選擇以及菠蘿相關遺傳研究都極為關鍵，但截至目前，有關此方面的研究仍未見報道。為此，利用RAPD、ISSR、SSR、SCoT對來自世界不同國家的多種菠蘿種質進行了研究，著重比較了不同分子標記在菠蘿基因組中的檢測效率，以期為菠蘿分子標記研究水平提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗共選用了47份菠蘿種質，來源于世界上不同國家或地區，主要包括中國臺灣、中國海南、巴西、日本、印度尼西亞、澳大利亞、泰國、哥斯達黎加、毛里求斯。試驗材料由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 DNA提取

每份材料隨機選取10～15株單株的幼嫩葉片等量混合，采用改良的SDS法[8]混合提取基因組總DNA，經紫外分光光度計測定濃度后，稀釋至適合工作濃度備用。

1.3 分子標記檢測

PCR擴增反應在Eppendorf PCR擴增儀上完成。PCR反應總體積20 μL，反應體系的組成根據不同類型分子標記的特點對基因組DNA、引物、10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq酶和ddH2O進行相應的調整。PCR擴增程序也根據不同分子標記特點確定。對SSR擴增產物主要采用6%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，其他標記則通過1.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.4 數據統計及分析

以0、1、9統計SCoT擴增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”，并建立分子數據矩陣。采用POPGEN32軟件估算SCoT標記的主要遺傳多樣性參數，包括引物擴增總條帶數（TNB）、多態性條帶數（NPB）、多態性條帶百分比（PPB）、有效等位基因數（Ne）、Neis基因多樣性指數（H）、Shannons信息指數（I）和多態性信息含量（PIC）。

2 結果與分析

2.1 不同分子標記多態性引物在菠蘿中的篩選率比較

利用兩個表型性狀差異明顯的菠蘿種質對不同類型分子標記進行了篩選，具體信息見表1。從表1可以看出，不同分子標記在菠蘿種質中的篩選率差異較大，其中RAPD標記的篩選率最高，達到了47.06%，其次是ISSR標記，篩選率為43.33%，SSR標記和SCoT標記的篩選率都較低，分別為28.57%和24.44%。這種篩選率的狀況在一定程度上也反映了不同分子標記的特點及差異，作為隨機擴增標記的RAPD和ISSR，由于不具有種屬特異性而具有很高的多態性引物篩選率，而具有特異種屬限制的SSR標記其篩選率就相對較低，雖然SCoT也是一種隨機擴增引物，但其篩選率卻較低，這可能與其設計特性有關。

2.2 不同分子標記在菠蘿基因組中的擴增信息比較

不同分子標記在菠蘿基因組中擴增差異較大，從表2可知，不同分子標記在擴增總條帶、多態性條帶及多態性條帶百分比方面都存在明顯差異。在擴增總條帶方面，ISSR表現最好，其單個引物最多擴增出了238個條帶，其平均擴增條帶數也達到了140.86，這在4種類型標記中都是最高的；其次是RAPD標記，其單個引物擴增條帶數平均為123.57；SCoT標記和SSR標記平均擴增條帶數相對較低，其中SSR標記最差，其單個引物平均擴增條帶數只有80.75。4種標記在多態性條帶方面與擴增總條帶數有所不同，單個引物擴增多態性條帶數平均值最高為124.57，最低只有75，4種標記單個引物擴增平均多態性條帶數從大到小順序為ISSR、SCoT、RAPD、SSR。另外可以看出，每種分子標記不同引物間無論是在擴增總條帶數目還是在多態性條帶數目方面差異都很大。與擴增條帶數不同，多態性條帶百分比可以比較綜合地反映出不同分子標記的多態性檢測效率，從表2以看出，4種分子標記間多態性條帶百分比差異較大，其中SSR的多態性條帶百分比最高，達到了92.88%，其次是ISSR和SCoT，其多態性條帶百分比比較接近，都在88%，RAPD多態性條帶百分比最低，只有78.49%。從以上分析可以看出，在菠蘿基因組擴增方面，SSR和ISSR表現相對較好。

2.3 不同分子標記主要遺傳多樣性參數比較

試驗也對不同分子標記的主要遺傳多樣性參數進行了比較，具體見表3。從表3可以看出，不同分子標記在3種主要遺傳參數方面差異較大。在有效等位基因數方面，4種標記中RAPD表現最好，其平均值最大，達到了1.46，其次是SCoT標記，其表現與RAPD十分接近，平均值也達到了1.45，ISSR的有效等位基因數最低，只有1.35；同時可以看出，每種標記不同引物間有效等位基因數變化都較大，其中以SCoT和RAPD的變化為最大。在Neis基因多樣性指數方面，不同類型標記間差異相對較小，其中SCoT的Neis基因多樣性指數最大，其次是SSR和RAPD，ISSR相對最小。4種標記的Shannons信息指數介于前兩個參數之間，其中，SSR和SCoT的Shannons信息指數相對較大，都達到了0.41，RAPD為0.39，ISSR最小，只有0.36。從4種分子標記主要遺傳多樣性參數來看，SCoT和SSR綜合表現相對較好。

2.4 不同分子標記多態性信息量比較

多態性信息量是進行分子標記評價的重要參數，故試驗對4種分子標記的多態性信息量進行了比較分析。從表4可以看出，不同分子標記間多態性信息量變化都較大，其極差介于0.23～0.42之間，其中SCoT標記變化最大，而ISSR標記的變化最小。從多態性信息量的極值表現來看，SCoT和SSR的最大值表現最好，而RAPD的最小值表現最差。多態性信息量平均值可以較均衡地反映出不同分子標記間的差異，可以看出SCoT標記多態性信息量整體表現最好，其平均值達到了0.30，其次是SSR標記，其平均值略低于SCoT，為0.29，而ISSR和RAPD標記的多態性信息量較低，都為0.24。從4種分子標記多態性信息量的綜合表現來看，SCoT和SSR相對最好。

3 小結與討論

分子標記技術的應用有效加快了菠蘿遺傳育種及其相關研究的進展，而在分子標記應用中，基因組檢測效率是較為重要的一項內容，同時它也是開展菠蘿其他相關遺傳研究的重要基礎。近年來，隨著新的分子標記技術的不斷開發，越來越多的分子標記被逐步應用于菠蘿研究中，而不同分子標記的設計特點決定了其在菠蘿基因組多態性檢測中具有特定的檢測效率，因此開展不同分子標記在菠蘿中檢測效率的比較分析較為重要。試驗對ISSR、SSR、SCoT、RAPD 4種分子標記在菠蘿中的檢測效率進行了比較分析，選取了可用于檢測效率比較的多種考查指標，主要包括引物篩選率、基因組擴增條帶數、多態性條帶百分比、有效等位基因數、Neis基因多樣性指數、Shannons信息指數和多態性信息含量，結果表明，各分子標記在不同檢測指標方面表現各有優劣，例如，RAPD在引物篩選率方面表現最好，ISSR在擴增條帶數方面最為突出，而SCoT和SSR的主要遺傳多樣性參數相對較高，因此，在利用分子標記進行菠蘿種質研究時，應該根據特定的研究目標及研究條件等選擇適合的標記類型，當然多種類型分子標記的有效結合無疑是獲得理想研究結果的有效途徑。關于不同分子標記的效率比較分析，在其他如油菜[9]、葡萄[10]、中藥材[11]、柳枝稷[12]等上已開展了較多的研究，但與本研究相比，這些研究不僅選用的分子標記類型較少，而且在分子標記比較時選取的考察指標少且單一，因此，本研究結果在為菠蘿分子標記的高效利用提供重要科學依據的同時，對其他植物分子標記的應用及相關研究也具有一定的參考價值。

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