獅頭鵝大腸桿菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及滅活疫苗的制備

楊培奎 張振霞 沈浩鐸 施偉斌 查廣才 莊東紅 鄭玉忠

摘要：為了分析廣東某獅頭鵝種鵝場(chǎng)鵝卵黃性腹膜炎的病原，從病死雌性種鵝中分離得到1株菌株。通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)形態(tài)、鏡檢、生化鑒定以及16S rRNA基因序列同源性比對(duì)，確定分離的菌株為大腸桿菌。抗生素和中草藥水提取物對(duì)分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，恩諾沙星、頭孢噻肟和中草藥丁香對(duì)分離菌株的抑制和殺滅效果最好。用分離菌株制備的滅活疫苗，經(jīng)無(wú)菌檢測(cè)、試驗(yàn)動(dòng)物安全性和免疫效果檢驗(yàn)，結(jié)果表明，該疫苗是安全的，并對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物具有一定的免疫保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：獅頭鵝；卵黃性腹膜炎；大腸桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)；滅活疫苗

中圖分類號(hào)：S835 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2679-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.032

Isolation and Indentification，Drug Sensitivity Test and Inactivated Vaccine Development of Escherichia coli from Shitou Geese

YANG Pei-kui1，ZHANG Zhen-xia1，SHEN Hao-duo2，SHI Wei-bin3，ZHA Guang-cai1，

ZHUANG Dong-hong1，ZHENG Yu-zhong1

（1. Hanshan Normal University， Chaozhou 521041， Guangdong， China； 2. Guangdong Chaozhou Agricultural Science and Technology Development Center， Chaozhou 521011， Guangdong， China； 3. Chaoan Fengtang Weibin Farm， Chaozhou 515646， Guangdong， China）

Abstract： In order to analyze the pathogen of yolk peritonitis in Shitou geese，a strain was isolated from a dead female goose in Guangdong province.The results showed that the strain was identified as E.coli based on morphology，biochemical characters and phylogenetic analysis of 16S rRNA genes. Drug sensitivity test of the strain to antibiotic and Chinese herbal medicine extracts showed that E.coli was sensitive to Enrofloxacin，Cefotaxime Sodium and extracts from Eugenia caryophyllata. Inactivated vaccine prepared with the strain was proved safe and effective by sterility test， safety test and effect test.

Key words：shitou geese；yolk peritonitis；Escherichia coli；isolation and identification；drug sensitivity test；inactivated vaccine

獅頭鵝原產(chǎn)于廣東省粵東地區(qū)，是國(guó)內(nèi)外最大的肉用型鵝種之一。雖然作為一種大型食草水禽，其具有飼養(yǎng)相對(duì)簡(jiǎn)單、飼料成本低、抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，細(xì)菌性疾病不斷出現(xiàn)，其中大腸桿菌病是常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病。鵝卵黃性腹膜炎俗稱“蛋子瘟”，是一種常見(jiàn)于產(chǎn)蛋鵝的細(xì)菌性傳染病，主要由大腸桿菌侵害成年鵝的生殖器官引起。該細(xì)菌性傳染病主要發(fā)生于種鵝產(chǎn)蛋期，發(fā)病時(shí)會(huì)造成產(chǎn)蛋率急劇下降甚至死亡，常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B鵝業(yè)[1]。

傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定主要依據(jù)形態(tài)、生化以及免疫等檢查結(jié)果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，基于PCR和基因測(cè)序的分析技術(shù)也大量地應(yīng)用于細(xì)菌的分離和鑒定，如Woese等[2]提出的利用16S rRNA基因的同源性分析原核生物的進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育。由于16S rRNA的遺傳較為穩(wěn)定且序列信息量適中，同時(shí)目前已經(jīng)報(bào)道的細(xì)菌16S rRNA達(dá)400萬(wàn)多個(gè)，因此通過(guò)16S rRNA的序列分析，可以將細(xì)菌鑒定到屬或種。

本研究對(duì)廣東省潮州地區(qū)某獅頭鵝種鵝場(chǎng)因鵝卵黃性腹膜炎致死的雌性種鵝進(jìn)行細(xì)菌分離，在傳統(tǒng)形態(tài)和生化分析的基礎(chǔ)上結(jié)合16S rRNA基因序列比對(duì)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。同時(shí)，利用常用抗生素和中藥提取物針對(duì)分離的病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并嘗試滅活疫苗的制備研究，以期為獅頭鵝大腸桿菌病的預(yù)防和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 廣東省潮州市某獅頭鵝種鵝場(chǎng)病死的雌性種鵝，采集其肝臟、心血、胰臟、腹腔積水等。

1.1.2 試劑 大腸桿菌生化鑒定條為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，麥康凱瓊脂為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Biowest公司產(chǎn)品、DNA Marker（DL2000），PCRmix Taq為廣州昂科生物科技有限公司產(chǎn)品；Sanprep柱式DNA回收試劑盒為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物合成 根據(jù)文獻(xiàn)[3]提供的細(xì)菌16S rRNA基因引物序列設(shè)計(jì)引物，16S上游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′，16S下游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 取病死雌性種鵝的肝臟、心血、胰臟、腹腔積水等接種于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)及染色特性[4]。

1.2.2 生化試驗(yàn) 將麥康凱培養(yǎng)基上分離純化的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，200 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h，取一定量的菌液接種于大腸桿菌生化鑒定條的反應(yīng)管，具體操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行，并在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后判斷結(jié)果。

1.2.3 分離菌株16S rRNA基因的克隆及序列分析 將分離純化得到的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，并200 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h，取1 μL菌液作為模板進(jìn)行菌液PCR。用16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存 12 h。PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用DNA凝膠回收試劑盒純化回收后送至華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用Blast進(jìn)行同源序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)的繪制。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用二倍稀釋法[5，6]測(cè)定8種抗生素（紅霉素、氨芐霉素、慶大霉素、萬(wàn)古霉素、強(qiáng)力霉素、土霉素、恩諾沙星和頭孢噻肟）和4種中藥（丁香、五味子、八角、山萸肉）的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。取96孔培養(yǎng)板，將每種藥物作為一組，每組12孔，向第1號(hào)孔加入300 μL液體培養(yǎng)基，其余11孔每孔加入200 μL液體培養(yǎng)基，再向1號(hào)孔加入100 μL藥液，充分混勻后，從1號(hào)孔中取出200 μL放入2號(hào)孔，以此類推，然后從11號(hào)孔吸出200 μL棄去，再向12個(gè)孔中各加入10 μL菌液（2×107 CFU/mL）。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后取出觀察。凡是藥物最高稀釋孔中無(wú)菌生長(zhǎng)，且在加入MTT（5 μL，5 mg/mL）37 ℃孵育30 min未變藍(lán)色的，該孔的藥物濃度即為該種藥物對(duì)該菌的最小抑菌濃度（MIC）。在MIC的基礎(chǔ)上，取無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的各孔培養(yǎng)液涂布于LB瓊脂平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。平板上無(wú)菌生長(zhǎng)且藥物濃度最低的，即為該藥物對(duì)該菌的最低殺菌濃度（MBC）。

1.2.5 滅活菌苗的制備及免疫檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[7]并做適當(dāng)改進(jìn)，將分離得到的菌種接入LB液體培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床200 r/min，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后用瓊脂平板計(jì)數(shù)，并用無(wú)菌生理鹽水將細(xì)菌濃度調(diào)至2×1010 CFU/mL。向菌液中加入一定量的甲醛溶液，并使其終濃度為0.3%，置于恒溫?fù)u床200 r/min，37 ℃培養(yǎng)48 h。將滅活菌苗與等體積的無(wú)菌氫氧化鋁膠溶液充分混合后備用。取一定量的鋁膠佐劑滅活疫苗分別接種于LB瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

1.2.6 攻毒試驗(yàn) 隨機(jī)挑選20只健康小白鼠均分為兩組，試驗(yàn)組采用腹腔注射的方式接種0.4 mL鋁膠佐劑滅活疫苗；另外10只小鼠作為對(duì)照組，分別注射0.4 mL的滅菌生理鹽水，連續(xù)7 d觀察小鼠的進(jìn)食、活動(dòng)以及發(fā)病情況。7 d后對(duì)所有小鼠統(tǒng)一接種0.4 mL（2×1010 CFU/mL）含有活菌的菌液，進(jìn)行菌苗的免疫攻毒測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離和形態(tài)觀察

從病死雌性種鵝分離到一株疑似大腸桿菌，命名為A菌株。A菌株在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為邊緣整齊、隆起、表面光滑濕潤(rùn)的圓形紅色菌落（圖1），經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為陰性（圖2），且呈兩段鈍圓的短桿菌，初步判斷為大腸桿菌。

2.2 生化鑒定及16S rRNA序列分析的結(jié)果

將A菌株接種于腸桿菌科生化鑒定試劑盒，生化反應(yīng)結(jié)果符合腸桿菌科細(xì)菌特征（表1）。由表1可知，該菌株對(duì)靛基質(zhì)和甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)檸檬酸鹽和VP反應(yīng)呈陰性反應(yīng)。該結(jié)果符合大腸桿菌的生化試驗(yàn)特性。

利用16S rRNA基因引物對(duì)A菌株進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，得到約1.5 kb的惟一DNA片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后進(jìn)行產(chǎn)物回收和測(cè)序。結(jié)果表明A菌株的16S rRNA長(zhǎng)度為1 378 bp，經(jīng)過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的與16S rRNA序列進(jìn)行相似性分析，A菌株與E.coli的16S rRNA基因序列的同源性高達(dá)99%，因此判定A菌株為大腸桿菌，其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。

2.3 細(xì)菌對(duì)抗生素和中草藥水提物的敏感性

由表2可知，A菌株對(duì)于供試的8種抗生素的敏感性存在很大的差別。其中，慶大霉素的MIC和MBC超過(guò)了試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍，即MIC和MBC均超過(guò)2 500 μg/mL；而A菌株對(duì)恩諾沙星和頭孢噻肟非常敏感，恩諾沙星對(duì)A菌株的MIC和MBC均達(dá)到1.563 μg/mL；頭孢噻肟對(duì)A菌株的MIC和MBC也達(dá)到3.125 μg/mL。氨芐霉素的MIC和MBC均為625 μg/mL；紅霉素、萬(wàn)古霉素對(duì)A菌株的抑菌效果一致，MIC和MBC均為312.500 μg/mL；土霉素的MIC和MBC均為125 μg/mL。供試的8種抗生素中恩諾沙星的抑菌和殺菌效果最佳，頭孢噻肟次之，而慶大霉素的效果最差。

中草藥水提物對(duì)A菌株的抑制和殺滅效果如表3所示。由表3可知，丁香的效果最佳，其MIC和MBC分別為0.864 mg/mL和1.729 mg/mL；五味子的效果次之，MIC和MBC均為2.842 mg/mL；八角的抑菌和殺菌效果最差。由結(jié)果可知，抗生素恩諾沙星、頭孢噻肟以及中草藥丁香對(duì)于A菌株的抑制或者殺滅效果顯著，因此可以用于該類型病原菌的防治。

2.4 滅活疫苗的免疫效果

A菌株的鋁膠佐劑滅活疫苗接種于LB瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基后在37 ℃培養(yǎng)48 h，未發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)；腹腔接種于小鼠后，未發(fā)現(xiàn)小鼠精神萎靡或者食欲下降等情況，注射部位也未見(jiàn)腫脹、化膿等異常表現(xiàn)，且存活率達(dá)到100%，表明此次制備的A菌株鋁膠佐劑滅活疫苗具有較高的安全性。

2.5 攻毒試驗(yàn)

攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然免疫組小鼠在攻毒后出現(xiàn)短暫的精神萎靡以及24 h內(nèi)有2只小鼠死亡的情況，但是對(duì)照組小鼠在攻毒24 h后出現(xiàn)9只小鼠死亡。因此接種A菌株鋁膠佐劑滅活疫苗對(duì)于有機(jī)體抵御致病性A菌株的攻擊具有一定的作用。

3 討論

有研究指出利用16S rRNA鑒定細(xì)菌時(shí)，同屬細(xì)菌的16S rRNA基因的序列同源性應(yīng)至少在97%以上[8]，而徐朋朋等[9]在鑒定雞源大腸桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，分離的大腸桿菌與同科的志賀菌屬的16S rRNA保守序列相似度達(dá)到了99%。因此，在大腸桿菌時(shí)將傳統(tǒng)鑒定方法和分子方法結(jié)合十分必要。本研究中，分離菌株在特異顯色培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)特征，革蘭氏染色鏡檢及生化鑒定結(jié)果均符合大腸桿菌的特征，其16S rRNA基因序列經(jīng)比對(duì)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中大腸桿菌16S rRNA的同源性高達(dá)99%，因此可以確定分離純化的菌株是大腸桿菌。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，8種供試的抗生素中恩諾沙星和頭孢噻肟對(duì)該菌株的抑制和殺滅效果最明顯，而氨芐青霉素和慶大霉素的效果最差。該結(jié)果與同類研究相比不完全一致，吳建忠等[10]在雞大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)先鋒噻肟（亦稱“頭孢噻肟”）為極敏藥物，氨芐青霉素和慶大霉素則為中敏藥物；胡方建等[11]發(fā)現(xiàn)鵝大腸桿菌對(duì)恩諾沙星高度敏感，對(duì)慶大霉素中度敏感。因此，不同來(lái)源的大腸桿菌對(duì)抗生素的敏感性是有差異的，所以在臨床中進(jìn)行藥敏性試驗(yàn)對(duì)于科學(xué)合理的使用抗生素藥物具有重要的參考意義。本研究還對(duì)中草藥水提液對(duì)大腸桿菌抑制和殺滅效果進(jìn)行分析，結(jié)果表明丁香的效果最佳。單一抗生素的長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致微生物的耐藥性，而中草藥提取物雖然成分復(fù)雜但是可以達(dá)到多靶點(diǎn)殺菌的效果，進(jìn)而減少或者避免耐藥性的產(chǎn)生。因此，如能在養(yǎng)殖過(guò)程中合理使用抗生素藥物和中草藥，對(duì)于減少抗生素使用，減低耐藥性，提高細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療具有重要的價(jià)值。

由于各地鵝源致病性大腸桿菌血清型較多，且缺乏系統(tǒng)研究，因此分離本地區(qū)流行菌株，篩選免疫源性好的菌株制備滅活疫苗，是防治該病原菌切實(shí)有效的途徑[12]。本研究利用氫氧化鋁膠與滅活的細(xì)菌培養(yǎng)液混合制備鋁膠滅活疫苗，采用腹腔注射后能很好地為機(jī)體吸收，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)及活動(dòng)無(wú)不良影響。采用致病菌攻毒試驗(yàn)檢驗(yàn)免疫效果，表明疫苗具有一定的免疫保護(hù)性。

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