安絲菌素P—3的搖瓶發酵培養基優化

谷政偉 朱曉媛 黎繼烈

摘要：為了優化安絲菌素P-3（AP-3）的搖瓶發酵培養基，以AP-3產量為主要指標，在單因素試驗的基礎上，利用均勻試驗設計U*15（157）對培養基中碳源、氮源和前體異丁醇進行優化。得到最適培養基配方為葡萄糖4.22%，麥芽糖0.75%，玉米漿3.42%，乙酸銨0.41%，異丁醇0.43%，碳酸鈣0.50%，氫氧化鈉0.12%，磷酸氫二鉀0.10%，pH（7.4±0.2）。在此條件下進行驗證試驗，AP-3產量為（51.86±1.33） mg/L，與模型預測值接近。表明該優化方法切實可行，能夠獲得較高的AP-3產量。

關鍵詞：安絲菌素P-3；發酵；培養基；優化

中圖分類號：TQ920.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2707-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.039

Optimization of Shaking-flask Fermentation Medium for Ansamitocin P-3

GU Zheng-wei，ZHU Xiao-yuan，LI Ji-lie

（Central South University of Forestry and Technology/2011 Cooperative Innovation Center of Cultivation and Utilization for Non-Wood Forest Trees of Hunan Province/Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-wood Forest Trees，Ministry of Education，Changsha 410004，China）

Abstract： In order to optimize the shaking-flask fermentation medium for ansamitocin P-3（AP-3），the yield of AP-3 was used as major index， based on the single experiment， carbon sources， nitrogen sources and precursor isobutanol were optimized by the design method of even experiment U*15（157）.The optimum medium formulas were glucose 4.22%，maltose 0.75%，corn steep liquor 3.42%，ammonium acetate 0.41%，precursor isobutanol 0.43%，CaCO3 0.50%，NaOH 0.12%，K2HPO3 0.10%，pH （7.4±0.2）.Under the above condition， the yield of AP-3 was up to（51.86±1.33） mg/L， closely to the prediction of the model. Relatively high yield of AP-3 was gained by this feasible optimization.

Key words： ansamitocin P-3； fermentation； medium； optimization

安絲菌素（Ansamitocins）是一類由橙色珍貴束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum）發酵生成的美登素類抗生素[1]，具有抗腫瘤、抗細菌、抗結核桿菌等生理活性[2，3]，其衍生物可以作為“彈頭”與單抗結合形成活性高、副作用小的抗體-藥物偶聯物（Antibody-drug conjugates，ADCs）[4-7]。根據C-3側鏈的碳鏈長度不同，安絲菌素可分為P-1、P-2、P-3、P-3和P-4五個組成部分，其中安絲菌素P-3是主要發酵產物[8，9]。

培養基組成是發酵過程必須考慮的因素，碳源對微生物生長代謝的作用主要是提供細胞及合成產物的碳架，提供細胞生命活動所需的能量。氮源主要用于合成氨基酸、蛋白質、核酸等菌體細胞物質和含氮代謝物，包含有機氮源和無機氮源，兩者通常在發酵過程中混合使用。前體是次級代謝物生物合成的主要限制因素，往往決定抗生素的產量與質量，主要來源于脂肪酸、單糖、蛋白質等含碳物質的代謝，還有些源于主代謝中無作用酶的催化產物。

本研究利用單因素試驗考察培養基中不同碳源、氮源對安絲菌素P-3（AP-3）產量的影響，展開均勻試驗設計U*15（157）對碳源、氮源和前體異丁醇的濃度進行優化，以期為AP-3和橙色珍貴束絲放線菌的進一步開發與研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：橙色珍貴束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum spp. auranticum，APSP-01），由中南林業科技大學發酵工程實驗室提供。

主要試劑：AP-3標準品（HPLC）、玉米漿為美國Sigma公司產品；無水甲醇（HPLC）、甘油為分析純，為天津市富宇精細化工有限公司產品；酵母浸粉為英國OXOID公司產品；麥芽糊精為上海楷洋生物技術有限公司產品：麥芽浸粉、蛋白胨（分析純）為北京奧博星生物技術有限責任公司產品；可溶性淀粉、蔗糖、無水葡萄糖、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、95%乙醇、麥芽糖、碳酸鈣、異丁醇、瓊脂均為國產分析純。

主要儀器：P680型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；CJ-ID型水平超凈工作臺（天津市泰斯特儀器有限公司）；ZWY-2102C立式全溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基 ①單菌落分離平板培養基。甘油1.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，瓊脂2.0%，pH（6.8±0.2），121 ℃滅菌20 min。②種子培養基。甘油1.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，pH （6.8±0.2），121 ℃滅菌20 min。③初始搖瓶發酵培養基。麥芽糊精5.0%，大豆粉3.0%，碳酸鈣0.50%，氫氧化鈉0.12%，磷酸氫二鉀0.10%，異丁醇0.30%，pH （7.4±0.2）。

1.2.2 培養條件 ①單菌落分離平板培養。將甘油管保藏菌稀釋涂布到單菌落分離平板上，于28 ℃的生化培養箱中倒置培養72～144 h。②種子培養。從單菌落分離平板上挖出單菌落，加2 mL無菌水，再加10 個玻璃珠，振蕩均勻，制成菌懸液，然后將其接種于種子培養基上（裝液量為30 mL/150 mL三角瓶或50 mL/250 mL三角瓶），于全溫振蕩器中以轉速200 r/min、28 ℃條件下培養72 h。③發酵培養。250 mL三角瓶裝發酵培養基50 mL，將種子液以5%接種量接入培養基中，于立式全溫振蕩器中以轉速200 r/min、28 ℃條件下培養168 h。

1.2.3 安絲菌素P-3的檢測

1）色譜條件。色譜柱為Hyperclone C18柱（250 mm×4.60 mm×5 μm）；流動相為乙腈-水（V/V=70/30）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為252 nm；柱溫為25 ℃；進樣量20 μL。AP-3標準品（純度98%）的HPLC圖譜如圖1所示，所得AP-3標準品的峰面積為46.264。

2）標準曲線制作。取AP-3標準品用50%乙醇進行稀釋分別得到質量濃度為24.035、32.047、48.070、64.093、96.140 mg/L的系列標準溶液。在“1.2.3”中“1）”的色譜條件下平行測定3次，然后以濃度x（mg/mL）為橫坐標，平均峰面積y為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.493 1x-0.890 8，相關系數r=0.998 9。

3）發酵培養液中AP-3的測定。取5 mL發酵液于試管中，加入95%乙醇至10 mL，混合均勻，振蕩10 min 后以 8 000 r/min離心5 min除去菌絲體，然后取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC測定，根據標準曲線計算AP-3含量。

1.3 試驗設計

試驗采用單因素試驗和均勻試驗設計。利用單因素試驗考察了不同碳源、有機氮源和無機氮源對AP-3產量的影響，并根據單因素試驗結果，采用均勻試驗設計考察了發酵培養基組分葡萄糖、麥芽糖、玉米漿、乙酸銨、異丁醇5種因子對AP-3產量的影響。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同碳源對AP-3產量的影響 分別用5.0%葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘油替代初始搖瓶發酵培養基中的麥芽糊精，其他成分不變，按“1.2”中方法進行試驗，探討不同碳源對AP-3產量的影響，結果如圖2所示。由圖2可知，當碳源為甘油時，AP-3產量最低，當碳源為葡萄糖時，AP-3產量最高。這是因為葡萄糖是一種速效碳源，是菌體最好的生長碳源；麥芽糖作為碳源時，AP-3產量也較高，這是因為碳源調控可能與次級代謝酶的直接抑制有關，適宜的培養基中一般包含適量的速效碳源和遲效碳源，速效碳源可被菌體快速利用，是菌體最好的生長碳源，但可能影響次級代謝物的形成，遲效碳源通常是發酵生產次級代謝物的最好碳源，可以與速效碳源一起加入。因此，選取葡萄糖、麥芽糖作為組合碳源進行均勻試驗設計。

2.1.2 不同有機氮源對AP-3產量的影響 分別用3.0%蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、玉米漿、麥芽浸粉替代初始搖瓶發酵培養基中的大豆粉，其他成分不變，按“1.2”中方法進行試驗，探討不同有機氮源對AP-3產量的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，有機氮源為玉米漿時，AP-3產量最高，使用蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉為有機氮源時，AP-3產量偏低。這是因為有機氮源是影響放線菌正常生長的重要因素，對次級代謝物的產量有重要作用，而玉米漿含有豐富的氨基酸、微量元素和生長素等物質，可能有利于AP-3的產生。因此，選擇玉米漿為最佳有機氮源。

2.1.3 不同無機氮源對AP-3產量的影響 在“2.1.2”試驗結果的基礎上，再在初始搖瓶發酵培養基中分別加入0.3%的硫酸銨、乙酸銨、氯化銨、硝酸銨、碳酸氫銨，其他成分不變，按“1.2”中方法進行試驗，探討不同無機氮源對AP-3產量的影響，結果如圖4所示。由圖4可知，乙酸銨可以提高AP-3產量，而其他銨鹽特別是硝酸銨明顯抑制AP-3產量，與專利報道一致[10]。可能原因是添加銨鹽等速效無機氮源可供前期菌體的快速生長，然而一定濃度的銨離子對許多次級代謝過程產生負作用，產生銨離子效應，抑制AP-3產量。

2.2 均勻設計試驗結果

根據單因素試驗結果，采用均勻試驗設計考察發酵培養基組分對AP-3產量的影響。選用U*15（157）均勻設計表，考察葡萄糖、麥芽糖、玉米漿、乙酸銨、異丁醇5種因子不同水平對珍貴橙色束絲放線菌APSP-01產AP-3的影響，每組試驗重復2 次。U*15（157）均勻設計試驗結果如表1所示。

使用DPS 7.05軟件對表3的數據進行二次多項式逐步回歸分析，得出AP-3產量與各因素關系的方程為：

y=-5.795-0.234x2-74.798x5+0.269x1x2+49.531x1x4+8.818x1x5+7.417x3x4-0.680x3x5+0.503x22+77.806x52

R2=0.989 9，模型P<0.01，回歸方程擬合極顯著，對所得的回歸擬合方程中的變量分別求一階偏導數，解方程的最優結果為：葡萄糖4.22%，麥芽糖0.75%，玉米漿3.42%，乙酸銨0.41%，異丁醇0.43%，預測AP-3產量的最優結果為53.87 mg/L。在最優條件下進行6次平行試驗，AP-3實際產量為（51.86±1.33） mg/L，說明回歸模型真實可靠。

3 小結

目前安絲菌素生產水平低，市場價格昂貴。采用微生物發酵法制備安絲菌素具有周期短、費用低、操作簡單等優點，是解決上述問題的有效方法。本研究通過單因素試驗確定培養基中最適碳源、氮源，展開均勻試驗設計U*15（157）優化培養基中兩種碳源（葡萄糖、麥芽糖），兩種氮源（玉米漿、乙酸銨）和前體異丁醇共5種成分的濃度。優化搖瓶培養基的配方為葡萄糖4.22%，麥芽糖0.75%，玉米漿3.42%，乙酸銨0.41%，異丁醇0.43%，碳酸鈣0.50%，氫氧化鈉0.12%，磷酸氫二鉀0.10%，pH （7.4±0.2），在此條件下，AP-3產量為（51.86±1.33） mg/L，與模型預測值接近。表明該優化方法切實可行，能夠獲得較高的AP-3產量。這對今后AP-3的進一步研究及其發酵過程放大等工作的展開具有積極意義。

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