石油烴降解菌CQ6產生物表面活性劑發酵條件的優化

付瑞敏 楊雪 谷亞楠 薛婷婷 邢文會 張紅 張麗琴 常慧萍 陳五嶺

摘要：為了了解長慶油田石油烴降解菌產生物表面活性劑的情況，對菌株CQ6以原油為碳源時石油的降解率和發酵液表面張力進行了研究，并采用響應面分析法對該菌產生物表面活性劑的發酵條件進行了優化，在單因素的基礎上，選擇溫度、轉速和初始加油量3個因素，利用Box-Behnken中心組合原理和響應面分析法對數據進行了回歸分析，得到了石油烴降解菌CQ6產生物表面活性劑的二次多項式回歸方程的預測模型。結果表明，菌株CQ6產生物表面活性劑的最佳條件為溫度25 ℃、轉速190 r/min、接種量3.4%。在此條件下，菌株CQ6對石油的降解率可由優化前的64.4%升高至80.2%，菌株發酵液的表面張力由優化前的32.5 mN/m降至27.0 mN/m。

關鍵詞：石油烴降解菌；生物表面活性劑；發酵；響應面分析；優化

中圖分類號：TQ920.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2710-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.040

Optimization of Conditions for Petroleum-degrading Bacteria CQ6

Producing Biosurfactant

FU Rui-min1，2，YANG Xue1，GU Ya-nan2，XUE Ting-ting2，XING Wen-hui1，ZHANG Hong1，ZHANG Li-qin1， CHANG Hui-ping1，CHEN Wu-ling2

（1.Department of Life Science，Henan Institute of Education，Zhengzhou 450046，China；

2.College of Life Science，Northwest University，Xian 710069，China）

Abstract： In order to determine the surfactant-producing situation of petroleum-degradation bacteria in Changqing oil field， degradation rate of petroleum and surface tension of fermentation broth were studied when stain CQ-6 used crude oil as the carbon source， and the fermentation condition was optimized. Based on the single factor experiment， the temperature， the rotate speed and initial amount of oil as factors， the prediction model of quadratic regression polynomial equation on surfactant-producing was simulated with Box-Benhnken central composite principle and response surface methodology. The result showed that，the optimum condition of biosurfactant producing by strain CQ6 was as follows： the temperature was 25 ℃，the rotate speed was 190 r/min and the initial amount of oil was 3.4%.Under this condition， the degradation rate of petroleum increased from 64.4% to 80.2% and the surface tension of fermentation broth decreased from 32.5 mN/m to 27.0 mN/m compared with before optimization.

Key words： petroleum-degrading bacteria； biosurfactant； fermentation； response surface analysis； optimization

石油開采過程中由于原油泄漏所造成的石油污染是當前重要的環境問題，土壤受到石油的污染會造成性質的改變，從而使植被及農作物難以生長[1]。針對石油污染土壤的修復，當前研究的熱點集中于生物修復，即采用石油烴降解菌等微生物對石油的降解從而達到凈化土壤的目的[2]。在石油烴降解菌降解石油的過程中，其限制步驟主要是石油污染物從土壤到細菌細胞內部的傳遞速率，而表面活性物質的參與可加速該傳遞過程[3]。

生物表面活性劑是某些微生物代謝產生的大分子物質，它們具有表面活性，既有親水性，又有疏水性。與化學合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑具有無毒、可生物降解、高效的乳化性和環境相容性等優點[4，5]，這些優點決定了生物表面活性劑在石油污染環境的生物修復中扮演重要角色。目前，針對生物表面活性劑產生菌的篩選、鑒定、代謝產物的分析及發酵條件的優化等方面已展開了部分研究[6-8]。但對石油烴降解菌產生物表面活性劑條件優化的相關報道卻較少，且主要局限于采用單因素和正交試驗的方法[9]。

響應面分析法是采用多項式來模擬多因子試驗中各因素彼此間的相互關系，并在此基礎上構建響應面，通過響應面的函數分析來研究因子相互之間的關系，并對相關數據進行優化設計，由于這種方法設計合理，優化結果較為優良，故當前被越來越多的生物、食品行業人員所采用[10]。本試驗以從長慶油田分離得到的石油烴高效降解菌CQ6作為試驗菌株，利用單因素試驗考察了其發酵液表面張力和石油降解率，并在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法對菌株的發酵條件進行了優化，篩選出一組產生物表面活性劑的最適條件，以期為生物表面活性劑的開發和長慶油田石油土壤的原位修復奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 試驗所用的石油烴高效降解菌菌株CQ6分離自長慶油田石油污染土壤，鑒定結果為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），菌株由西北大學生命科學學院微生物實驗室提供，試驗用油采自長慶油田第三采油廠。

1.1.2 試劑、培養基與儀器 ①試劑：石油醚、無水硫酸鈉、硫酸，均為分析純。②培養基：LB培養基、無機鹽培養基。③儀器：WZY-1自動液體表面張力儀，上海衡平制造廠；759S紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 單因素試驗 試驗考察了不同溫度、pH、轉速和初始加油量對石油烴降解菌菌株CQ6產生物表面活性劑的影響。

1.2.2 響應面分析法優化試驗 以單因素試驗結果為依據，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，以溫度（A）、轉速（B）和初始加油量（C）作為自變量，發酵液表面張力（Y）為響應值，做3因素3水平的響應面分析優化試驗，試驗因素與水平如表1所示。

1.3 測定指標及方法

試驗菌株所產表面活性劑性能測定采用表面張力檢測法[11]，使用張力儀檢測發酵液的表面張力。試驗菌株對原油的降解率測定采用紫外分光光度法[12]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 溫度對菌株CQ6產生物表面活性劑的影響 溫度可影響微生物的生長與繁殖速率，在初始加油量4%，培養基pH 7.0時，試驗將培養基分別置于15、20、25、30、35、40 ℃下，在轉速為200 r/min的搖床中發酵培養24 h，分別測定各發酵液的表面張力，結果如圖1所示。由圖1可知，當溫度低于20 ℃和高于40 ℃時，發酵液的表面張力均較大，表明菌體代謝產生物表面活性劑的能力均較弱，而在溫度為25～35 ℃時，菌體可很好地生長并代謝產生表面活性劑，基于此結果，將25～35 ℃作為菌體產生物表面活性劑的最適溫度范圍。

2.1.2 pH對菌株CQ6產生物表面活性劑的影響 pH可通過影響細胞膜的通透性、細胞膜結構的穩定性和物質的溶解性來影響營養物質的吸收，從而影響菌體生長，進而影響生物表面活性劑的產量。在初始加油量4%時，將培養基的pH分別設置為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于30 ℃、轉速為200 r/min的搖床中培養24 h，測定各發酵液的表面張力，結果如圖2所示。由圖2可知，菌株CQ6在pH為6.5～7.5時長勢較好，所產生物表面活性劑較多，菌株發酵液的表面張力較低，且彼此間無較大差異，但當pH低于6.5或高于7.5時，發酵液的表面張力明顯增加，表明此時菌株CQ6產生物表面活性劑的能力明顯下降，菌株的生長受到抑制，基于此結果，將pH（6.5～7.5）選為菌株CQ6產生物表面活性劑的最適pH范圍。

2.1.3 轉速對菌株CQ6產生物表面活性劑的影響 搖床的轉速決定了菌株發酵液中的氧溶解量，由于石油烴降解菌降解石油通常是有氧代謝，故氧是石油烴降解菌CQ6降解石油過程中不可或缺的重要因素，轉速的大小直接決定了菌株數量的多少，進而影響生物表面活性劑的產量。將搖床轉速分別設置為140、160、180、200、220、240、260 r/min，于30 ℃、初始加油量4%、pH 7.0的條件下分別培養24 h，測定各發酵液的表面張力，結果如圖3所示。由圖3可知，菌株CQ6在轉速為180～220 r/min時長勢較好，產生物表面活性劑較多，表現為菌株發酵液的表面張力較低，當搖床轉速低于160 r/min和高于240 r/min時，發酵液的表面張力均有明顯提升，表明此時菌株活性降低，產生物表面活性劑的能力也下降。推測其原因一方面是轉速過低導致氧溶解量不足，從而引起菌體代謝減緩，產生物表面活性劑能力下降；另一方面是轉速過高導致過量的氧溶解，引起菌體將所產的生物表面活性劑也作為碳源消耗掉，最終導致生物表面活性劑產量下降。基于此，將180～220 r/min設置為產生物表面活性劑的最適轉速范圍。

2.1.4 初始加油量對菌株產生物表面活性劑的影響 試驗中所加入的原油是菌株CQ6惟一的碳源，因此初始加油量的多少直接影響菌體的生長狀況，進而影響菌株生物表面活性劑的產量。本研究將初始加油量分別設置為1%、2%、3%、4%、5%、6%，設置搖床轉速為200 r/min，于30 ℃、pH 7.0的條件下分別培養24 h，測定各發酵液的表面張力，結果如圖4所示。由圖4可知，當初始加油量低于3%時，發酵液的表面張力較高，說明菌體生長狀態不好，所產的生物表面活性劑不多，再次證明了充足的碳源會促進菌體生長并產生生物表面活性劑；初始加油量在3%～5%時，發酵液表面張力明顯下降，說明菌體在大量生長并產生生物表面活性劑，然而當初始加油量高于5%時，發酵液的表面張力有大幅度提升，推測可能的原因是初始加油量過多會導致油層覆蓋于培養基表面，初始加油量越大，則石油烴降解菌CQ6所能獲得的氧氣就越少，氧氣的缺乏可抑制菌株的正常生長，從而導致由菌株代謝所產的生物表面活性劑的產量也有所降低，進而菌株發酵液表面張力就會升高。基于以上結果，將初始加油量設置為3%～5%作為產生物表面活性劑的最適加油量范圍。

2.2 響應面分析法優化試驗結果

2.2.1 響應面分析法方案及結果 以溫度（A）、轉速（B）、初始加油量（C）為變量，以菌株發酵液的表面張力（Y）為響應值進行響應面分析法優化試驗，試驗方案及結果見表2。

2.2.2 多元二次響應面回歸模型的建立與分析 采用軟件Expert 8.0對表2中的結果進行二次回歸分析，構建出多元二次方程：

Y=29.57+0.50A-0.42B-0.09C+0.60AB-1.20AC+0.58BC-0.65A2-0.77B2-0.32C2+1.32A2B，各個因素的方差分析結果如表3所示。由表3可以看出，模型的P為0.020 5，小于0.05，說明回歸模型顯著，失擬項P為0.930 5，說明模型可靠，用該模型對石油降解菌CQ6產生物表面活性劑的發酵工藝進行預測和分析，結果準確。

根據回歸方程，獲得溫度、轉速和初始加油量彼此間兩兩交互對菌株發酵液表面張力的影響，圖5、圖6和圖7為相應的響應面曲線圖。由圖5、圖6、圖7可知，溫度、轉速和初始加油量彼此間兩兩交互對發酵液表面張力的響應值均存在最小值，經過響應面分析，3個影響菌體發酵液表面張力的關鍵因素溫度、轉速、初始加油量的最優試驗點分別是25 ℃、190.40 r/min、3.41%，在此條件下，預測其表面張力為26.893 7 mN/m。

2.2.3 發酵條件優化驗證 為了便于操作，將發酵的最優條件適度調整為溫度25 ℃、轉速190 r/min、初始加油量3.4%。經檢測，在優化前，菌株CQ6在搖床轉速為200 r/min，溫度為30 ℃，初始加油量為4%的條件下，對石油烴的降解率為64.4%，菌株發酵液的表面張力為32.5 mN/m；優化后，在溫度為25 ℃，搖床轉速為190 r/min，初始加油量為3.4%時，發酵液的表面張力降低至27.0 mN/m，較優化之前降低了16.9%，對石油烴的降解率提高至80.2%，較優化之前提高了15.8個百分點。

3 結論

本試驗對長慶油田高效石油烴降解菌CQ6進行了石油降解率和發酵液表面張力的研究，并采用Box-Benhnken和響應面分析法對該菌產表面活性劑的條件進行了優化，得出在溫度為25 ℃，搖床轉速為190.40 r/min，初始加油量為3.41%時，菌株發酵液表面張力預測值為26.893 7 mN/m。為檢驗該設計的可靠性，采用上述預測條件進行發酵，為了便于操作，將發酵的最優條件適度調整為溫度25 ℃、轉速190 r/min、初始加油量3.4%，在此條件下，測得菌株發酵液的實際表面張力為27.0 mN/m，接近理論預測值。由此可得，采用響應面分析法優化菌株CQ6產生物表面活性劑的發酵工藝，所得最佳條件可靠，具有實際應用價值。

目前對石油烴降解菌的研究主要集中于石油烴降解菌的篩選及降解性能的測定[13-15]，但有關石油烴降解菌所產生物表面活性劑的發酵條件優化的研究卻相對較少，且主要集中于單因素試驗和正交試驗。但上述方法存在下列缺陷：單因素試驗不考慮因素間的交互作用，正交分析又無法找出各個因素的最佳組合[16，17]。采用響應面分析法可克服上述存在的缺點。本試驗采用響應面分析法優化石油烴降解菌CQ6產生物表面活性劑的發酵工藝，此發酵工藝可使發酵液的表面張力比優化之前降低16.9%，對石油烴的降解率比優化之前提高15.8個百分點。

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