紅曲霉與紅花雙向發酵體系的初步研究

謝炎福 杜苗苗 張優儀

摘要：以紅曲霉（Monascus）作為發酵菌株，中藥紅花（Carthamus tinctorius）作為發酵基質進行了雙向發酵試驗。結果表明，紅花對于紅曲霉的生長和次級代謝產物莫那可林K （Monacolin K）的積累具有促進作用，同時基質中紅花黃色素提取率也得到了提高，經過對發酵條件的優化，雙向發酵的最佳工藝條件為紅曲霉接種量6%，紅花添加量3%，葡萄糖添加量6%，發酵溫度28 ℃，發酵11 d。在此工藝條件下，Monacolin K的產量達到25.23 mg/L，比未加紅花的對照提高了32.6%；紅花黃色素提取率為5.18%，比未加紅曲霉的對照提高了8.1%。

關鍵詞：紅曲霉（Monascus）；紅花（Carthamus tinctorius）；雙向發酵；紅花黃色素；Monacolin K

中圖分類號：TQ925+.7；Q93 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2718-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.042

Preliminary Study on Bi-fermentation of Monascus and Carthamus tinctorius

XIE Yan-fu，DU Miao-miao，ZHANG You-yi

（Department of Life Science， Luoyang Normal University， Luoyang 471022， Henan， China）

Abstract： The bi-fermentation experiment，Monascus as fermentation strain and traditional Chinese medicine Carthamus tinctorius as medium，was carried out. The result showed that，Carthamus promoted the growth of Monascus and the yield of Monacolin K，and simultaneously the extraction rate of yellow pigment in Carthamus tinctorius was increased. Through optimization of fermentation condition， the optimal technological parameters for production of yellow pigment in Carthamus tinctorius and Monacolin K in Monascus were obtained， that was Monascus inoculum 6%，Carthamus tinctorius 3%，glucose 6%， fermentation temperature 28 ℃，and aerobic fermentation time 11 d.Under this condition，the yield of Monacolin K was up to 25.23 mg/L， increased by 32.6% than the control without addition of Carthamus tinctorius， meanwhile yellow pigment was up to 5.18%， increased by 8.1% than the control without addition of Monascus.

Key words： Monascus； Carthamus tinctorius； bi-fermentation； yellow pigment in Carthamus tinctorius； Monacolin K

紅曲霉（Monascus）的使用在中國具有悠久的歷史，廣泛應用于食品、醫藥等多個領域，紅曲霉能產生紅曲色素、莫那可林K（Monacolin K）、γ-氨基丁酸等多種生物活性成分，具有很高的保健及藥用價值[1，2]。紅花（Carthamus tinctorius）具有活血化淤、抗腫瘤、抗菌等功效[3，4]，其生物活性成分主要為紅花黃色素[5]，紅花黃色素的傳統提取工藝為水浸法，提取率較低。紅曲霉和紅花在藥性機理上具有較高的相似性[6]，紅曲霉能產生淀粉酶、葡萄糖苷酶、纖維素酶等豐富的酶系[7]，能有效破除植物類中藥細胞壁和果膠類物質形成的物理屏障，使有效活性成分溶出，從而提高提取效率，具有對中草藥活性成分進行轉化、修飾以及產生新的活性物質的巨大潛力。將紅曲霉與紅花一起共同構建雙向發酵體系產生的藥性菌質比兩者分別入藥更能得到優勢互補的效果[8]。本研究在前期中藥篩選的基礎上，利用紅花作為紅曲霉發酵的藥性基質，旨在探討通過雙向發酵提高紅花活性成分紅花黃色素提取率以及紅曲霉中Monacolin K等有效活性成分含量的可行性，并進行發酵條件的初步優化，為紅曲霉藥性基質雙向發酵的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 紅曲霉為洛陽師范學院微生物實驗室保存菌種。紅花購自洛陽醫藥城，將紅花于60 ℃培養箱中干燥至質量恒定，用實驗室小型粉碎機粉碎過120目篩備用。

1.1.2 發酵培養基 參照文獻[9]的培養基配方并進行適當的改動，改動后的培養基配方：葡萄糖10 g，紅花粉20 g，硝酸鈉3 g，酵母提取物1 g，磷酸氫二鉀1 g，7水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，7水合硫酸亞鐵0.01 g，pH 5.6，用自來水定容至1 L。

1.1.3 試劑 葡萄糖、硝酸鈉、酵母膏、磷酸氫二鉀、7水合硫酸鎂、氯化鉀、7水合硫酸亞鐵、乙醇、石油醚等均為分析純。紅花黃色素純品（純度大于99%）；Monacolin K純品（純度大于99%）。以上藥品均購自鄭州三鑫化學試劑有限公司

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計：UV2000，島津；水浴恒溫振蕩器：SHZ-A，上海博迅實業有限公司；恒溫培養箱：DHP-9052，上海申賢恒溫設備廠；小型固體樣品粉碎機：FW-80，金壇市春蘭實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵種子液的制備 將經活化的紅曲霉斜面孢子用無菌水洗下，倒入含0.05%吐溫-80生理鹽水的三角瓶中，三角瓶中預先裝有數十粒玻璃珠，在搖床上振蕩，充分打散孢子，制成孢子濃度為1×106個/mL的孢子懸液，即為紅曲霉種子液。

1.3.2 發酵工藝流程 將80 mL發酵培養基裝入250 mL三角瓶中，于121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻后按照6%的比例接入預先制好的紅曲霉孢子懸液，在180 r/min、30 ℃搖床上培養3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續培養2～12 d（采用變溫發酵更有利于Monacolin K的產生[10]），隔天定時帶瓶稱質量，測量各項指標，發酵結束后，將發酵液過濾，烘干，稱量紅曲霉菌絲體生物量。

1.3.3 發酵條件優化單因素試驗 單因素試驗設計包括紅曲霉接種量：0、3%、6%、9%、12%；葡萄糖添加量：0、3%、6%、9%、12%；紅花添加量：0、1%、2%、3%、4%、5%；發酵時間：30 ℃發酵3 d后，28℃條件下繼續培養2～12 d；溫度：26、28、30、32 ℃。每個處理3次重復，分別測定紅曲霉菌絲體生物量，以Monacolin K含量、紅花黃色素提取率作為評價指標，培養方法同上，每次改變一個條件，測定不同條件下各指標的變化情況。

1.3.4 發酵條件優化正交試驗 選用L9（34）正交設計，在單因素試驗的基礎上，選取紅曲霉接種量、培養溫度、紅花添加量、葡萄糖添加量等4個培養條件進行優化，因素與水平見表1，并以紅花黃色素提取率、Monacolin K含量為考察指標確定最優發酵條件，每個試驗2個重復。

1.4 測定指標及分析方法

紅曲霉菌絲體生物量測定：采用重量法，將發酵液連帶菌絲球一起在3 000 r/min的搖床上離心15 min，收集沉淀，離心2次，將2次的沉淀物混合，在60 ℃烘箱中烘干至質量恒定，稱量。

Monacolin K含量測定：參照文獻[10]的方法，取6 mL發酵液，加入14 mL甲醇，搖床振蕩（30 ℃、200 r/min）2.5～3.0 h后，8 000 r/min離心20 min，上清液用有機濾膜過濾后，在236 nm波長處測定其吸光度。

紅花黃色素濃度測定：參照薛偉明等[11]的方法并略有改動。紅花黃色素提取率的計算公式[12]：紅花黃色素提取率=[（紅花黃色素濃度×稀釋倍數×提取液體積）/紅花質量]×l00%。

1.5 數據處理

所有數據采用SPSS軟件進行方差分析，多重比較采用最小顯著差數法（Least significant difference，LSD）法。

2 結果與分析

2.1 發酵時間對發酵結果的影響

在紅曲霉接種量6%，葡萄糖添加量1%，紅花添加量2%，搖床轉速180 r/min，30 ℃的條件下培養3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續培養2～12 d，以考察發酵時間對發酵結果的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，紅花黃色素提取率在發酵初期變化很小，發酵3 d后開始明顯上升，至發酵7 d時達到高峰，維持4 d后至發酵第11天開始下降，紅曲霉菌絲體生物量的變化與紅花黃色素提取率的變化基本一致，呈高度正相關。紅曲霉在葡萄糖存在的情況下，優先利用培養基中的葡萄糖作為碳源和能量來源，初期紅花黃色素主要來源于水的提取作用，葡萄糖將要耗盡時紅曲霉大量合成淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和其他酶類，分解紅花中的糖類、脂肪和纖維素類以供自身的生長，隨著這些營養成分的分解利用，打破了細胞壁和蛋白質的阻礙，有利于紅花黃色素從胞內溶出，后期紅花黃色素提取率下降可能是由于被紅曲霉轉變為其他物質或者代謝作為營養成分利用的結果。

Monacolin K含量呈現先增加后減少的趨勢，發酵初期幾乎測不到Monacolin K，Monacolin K含量高峰出現時間延后于菌體的產量高峰，說明Monacolin K是紅曲霉的次生代謝產物，只有在紅曲霉菌絲體量增加至平穩期后Monacolin K才大量合成。Monacolin K含量在發酵13 d時達到最大值，而紅花黃色素提取率在發酵7 d時達到最大值，在發酵第11天，兩者都相對較大，故選擇最佳雙向發酵時間為11 d，即30 ℃培養3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續培養8 d。

2.2 紅花添加量對發酵結果的影響

在紅曲霉接種量6%，葡萄糖添加量1%，搖床轉速180 r/min，30 ℃培養3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續培養8 d的發酵條件下，考察紅花添加量對發酵結果的影響，結果見圖2。由圖2可知，隨著紅花添加量的增大，紅曲霉菌絲體生物量、Monacolin K含量和紅花黃色素提取率均經歷了一個先增長后降低的過程，均在紅花添加量3%時達到最大值。說明一定量的紅花對于紅曲霉的生長和其有效活性成分Monacolin K的產生具有一定的促進作用。這可能是因為紅花含有紅花甙、肉桂酸、月桂酸等多種有效成分，刺激了紅曲霉的代謝活動，從而分泌大量的相關酶類分解紅花中的變性蛋白質作為自身的營養物質，提高了紅花黃色素的溶出率。

2.3 紅曲霉接種量對發酵結果的影響

在葡萄糖添加量1%，紅花添加量3%，搖床轉速180 r/min，30 ℃培養3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續培養8 d的發酵條件下，考察紅曲霉接種量對發酵結果的影響，結果見圖3。由圖3可知，隨著紅曲霉接種量的增大，紅曲霉菌絲體生物量增加，紅花黃色素提取率和Monacolin K含量則呈現先升高后降低的趨勢，紅花黃色素提取率在紅曲霉接種量6%時達到最大，Monacolin K含量則在紅曲霉接種量9%時達到最大。說明紅花黃色素提取率和Monacolin K含量并不一直隨著紅曲霉菌絲體生物量的提高而增大，接種量過大或過小均不利于Monacolin K的生成以及紅花黃色素提取率的提高。紅曲霉接種量增大，菌體代謝旺盛，分泌大量的胞外酶類，有利于發酵基質的利用和菌體的生長，但是接種量過大，會導致發酵液過于黏稠，影響溶氧含量，最終影響產物的合成。

2.4 葡萄糖添加量對發酵結果的影響

在紅曲霉接種量6%，紅花添加量3%，搖床轉速180 r/min，30 ℃培養3 d，然后降低溫度至28 ℃繼續培養8 d的發酵條件下，考察葡萄糖添加量對發酵結果的影響，結果見圖4。由圖4可知，隨著葡萄糖添加量的增加，Monacolin K含量、紅曲霉菌絲體生物量、紅花黃色素提取率均呈現先升高后降低的趨勢，說明葡萄糖過高或過低均不利于紅曲霉的生長以及相關酶類和次生代謝產物的積累。Monacolin K含量和紅曲霉菌絲體生物量均在葡糖糖添加量為6%時達到最大值，而紅花黃色素提取率在葡萄糖添加量為3%時達到最大值，雖然在葡萄糖添加量6%時有所下降，但并不是很明顯，所以仍取6%作為發酵時的適宜添加量。

2.5 溫度對發酵結果的影響

在紅曲霉接種量6%，葡萄糖添加量6%，紅花添加量3%，搖床轉速180 r/min，30 ℃培養3 d，然后調節至設定溫度（26～32 ℃）繼續培養8 d的發酵條件下，考察溫度對發酵結果的影響，結果見圖5。由圖5可知，紅曲霉菌絲體生物量和紅花黃色素提取率均隨著溫度的上升而逐漸提高，不加紅曲霉的對照組紅花黃色素提取率也呈現同樣的增加趨勢，但在同樣的溫度條件下，經過紅曲霉發酵的試驗組紅花黃色素提取率高于未經紅曲霉發酵的對照組。說明較高的溫度有利于紅花黃色素在水中的溶解，另一方面還說明較高的溫度有利于紅曲霉對紅花進行發酵，這可能和紅曲霉纖維素酶、蛋白酶、果膠酶的活性或紅曲霉發酵液在不同溫度下酶類的成分構成有關系，雙向發酵過程呈現的紅花黃色素提取率的提高是紅花黃色素溶出率隨溫度提高和紅曲霉的發酵共同作用的結果。Monacolin K含量和紅花黃色素提取率的變化趨勢相反，隨著溫度的上升，Monacolin K含量呈現一個逐漸下降的趨勢，但仍高于相應的不加紅花的對照組。說明低溫有利于Monacolin K的生成。綜合兩者的溫度曲線，在28 ℃時兩者產量均較高，所以確定28 ℃作為雙向發酵的控制溫度。

2.6 發酵條件優化正交試驗結果

相對于其他4個因素，發酵時間對發酵結果的影響比較一致，所以固定發酵11 d作為正交試驗的基礎條件。由表2可知，各因素對紅花黃色素提取率影響的主次順序為B、C、A、D，其優化組合為A2B3C2D1，即紅曲霉接種量6%、溫度30 ℃、紅花添加量3%、葡萄糖添加量3%時紅花黃色素提取率取得最大值；各因素對Monacolin K含量影響的主次順序為B、C、D、A，優化組合為A2B1C3D2，即紅曲霉接種量6%、溫度26 ℃、紅花添加量4%、葡萄糖添加量6%時Monacolin K含量最高。經方差分析得出，紅曲霉接種量、溫度、紅花添加量及葡萄糖添加量4個因素對Monacolin K含量均有極顯著影響（P<0.01）；接種量、溫度和紅花添加量對紅花黃色素提取率有極顯著影響，葡萄糖添加量對紅花黃色素提取率影響不顯著（P>0.05）。

由多重比較分析可知，Monacolin K含量在紅花添加量為3%和4%時無顯著差異，故雙向發酵的紅花添加量取3%，即C2；因葡萄糖添加量對紅花黃色素提取率無顯著影響，而Monacolin K含量在葡萄糖添加量為6%時最佳，故雙向發酵的葡萄糖添加量取6%，即D2；Monacolin K含量和紅花黃色素提取率的最佳條件在溫度方面差別很大，相對來說在B2水平，兩者均取得較高的產量。所以綜合考慮雙向發酵的最佳組合為A2B2C2D2，即紅曲霉接種量6%，發酵溫度28 ℃，紅花添加量3%，葡萄糖添加量6%。由于最佳發酵條件A2B2C2D2未出現在正交表中，故需要進行補充驗證試驗，在此條件下，驗證的結果為紅花黃色素提取率5.18%，比未利用紅曲霉發酵的對照組（4.79%）提高了8.1%，Monacolin K含量達到25.23 mg/L，比未加紅花的對照組（19.02 mg/L）提高了32.6%。

3 小結

紅花的適宜添加對于紅曲霉的生長和次級代謝產物Monacolin K的積累具有促進作用，紅曲霉以紅花作為藥性基質提高了紅花黃色素的提取率，紅曲霉和紅花雙向發酵能同時提高Monacolin K的產量和紅花黃色素的提取率；經過發酵條件的優化，最佳工藝條件為：紅曲霉接種量6%，紅花添加量3%，葡萄糖添加量6%，發酵溫度28 ℃，發酵11 d。在此最佳條件下，Monacolin K的產量達到25.23 mg/L，比未加紅花的對照組提高了32.6%；紅花黃色素提取率為5.18%，比未利用紅曲霉發酵的對照組提高了8.1%。紅曲霉和紅花雙向發酵相互影響，有可能對現有成分進行了生物轉化或產生了新的活性成分，有待繼續在這一方面進行深入研究。

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