水稻核糖體蛋白基因OsRPL2的克隆、序列分析及表達(dá)載體構(gòu)建

宋丹妮 王春臺(tái) 劉學(xué)群 譚艷平 劉新瓊 程鋼

摘要：依據(jù)鑒定得到的水稻（Oryza sativa L.）核糖體蛋白質(zhì)OsRPL2的序列設(shè)計(jì)了引物，從水稻葉片的cDNA中擴(kuò)增得到目的片段。并對目的基因序列進(jìn)行了測序鑒定和序列分析，同時(shí)在大腸桿菌中構(gòu)建水稻核糖體蛋白質(zhì)基因OsRPL2的原核表達(dá)載體pGEX-4T1-RPL2，轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）后利用IPTG誘導(dǎo)外源蛋白質(zhì)表達(dá)并檢測。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出了水稻核糖體蛋白質(zhì)基因OsRPL2的cDNA序列，大小為1 570 bp，其編碼的蛋白質(zhì)含有502個(gè)氨基酸。根據(jù)序列分析的結(jié)果，水稻OsRPL2基因與多個(gè)植物核糖體蛋白質(zhì)L2基因具有較高的相似性，并且其編碼的OsRPL2蛋白質(zhì)具有2個(gè)與核糖體蛋白質(zhì)功能相關(guān)的功能域。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了具有pGEX-4T1-RPL2重組子，誘導(dǎo)表達(dá)后，純化得到了帶有GST標(biāo)簽的可溶性O(shè)sRPL2蛋白質(zhì)。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；核糖體蛋白質(zhì)基因；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2773-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.056

Cloning and Sequence Analysis， Expression Vector Construction of a Ribosomal Protein Gene OsRPL2 from Rice

SONG Dan-ni， WANG Chun-tai， LIU Xue-qun， TAN Yan-ping， LIU Xin-qiong， CHENG Gang

（South-Central University for Nationalities/Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of

Special Plants in Wuling Area of China， Wuhan 430074，China）

Abstract： On the basis of identified rice ribosomal protein sequences，a primer was designed to amplify OsRPL2 gene from rice（Oryza sativa L.） leaves cDNA. The obtained sequence was sequenced and analyzed， meanwhile，inserted into plasmidp GEX-4T1 to generate a prokaryotic expression vector pGEX-4T1-RPL2 which was transferred into the Escherichia coli BL21 （DE3） strain， and then the protein expression was detected after induced by IPTG. The results showed that， the amplified fragment was identical to the cDNA sequence of OsRPL2 and contained a complete open reading frame of 1 570 bp， encoding a protein of 502 amino acid residues. Meanwhile，OsRPL2 gene has a high similarity with several plant ribosomal L2 genes，and the encoded OsRPL2 protein has two domains associated with ribosomal protein function. In addition， the soluble OsRPL2 protein with GST label was purified after IPTG inducing.

Key words： rice（Oryza sativa L.）； ribosomal protein gene； prokaryotic expression

核糖體蛋白質(zhì)是真核生物和原核生物細(xì)胞中一種豐富的蛋白質(zhì)，廣泛存在于高等植物的細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中，是生物細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，其蛋白質(zhì)占細(xì)胞蛋白質(zhì)的15%，在蛋白質(zhì)的生物合成中起重要作用。真核生物的核糖體為80S，由40S和60S兩個(gè)亞基構(gòu)成，包含3～4種RNA分子和80多種不同的蛋白質(zhì)[1]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白質(zhì)具有核糖體外功能，參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控，正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，細(xì)胞的凋亡調(diào)控，細(xì)胞的分裂、增殖、分化以及DNA修復(fù)等[2，3]，因此近年來核糖體蛋白質(zhì)的功能也受到越來越多的關(guān)注。

目前在真核生物中發(fā)現(xiàn)的核糖體蛋白質(zhì)有80余種，核糖體蛋白質(zhì)包括S1-S33，L1-L44，它們與核內(nèi)的rRNA結(jié)合分別構(gòu)成40S、60S大小亞單位[4]，有關(guān)核糖體和核糖體蛋白質(zhì)的研究主要集中在昆蟲、哺乳動(dòng)物、真菌和細(xì)菌，植物方面尤其是水稻中的表達(dá)情況研究的不多[5，6]。研究發(fā)現(xiàn)一些已知的核糖體蛋白質(zhì)有類似的功能，如黑麥的核糖體蛋白質(zhì)基因ScRPS7能抵抗低溫脅迫[7]，Kim等[8]發(fā)現(xiàn)小豆中的3個(gè)核糖體蛋白質(zhì)GmRPS13、GmRPS6、GmRPL37在轉(zhuǎn)錄或核糖體組裝過程中起到重要作用，并證明了其編碼基因可以提高小豆耐低溫的能力；杜志如等[9]發(fā)現(xiàn)水稻（Oryza sativa L.）OsRPL14基因在低溫和干旱時(shí)的表達(dá)量增加。水稻核糖體蛋白質(zhì)OsRPL2的功能目前未見報(bào)道。武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從構(gòu)建的水稻粵泰A品種cDNA文庫中鑒定得到了水稻核糖體OsRPL2基因，因此本研究將水稻OsRPL2基因進(jìn)行克隆并進(jìn)行序列分析及蛋白質(zhì)表達(dá)載體構(gòu)建，為深入研究OsRPL2基因的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)和線索。

1 材料與方法

1.1 材料

選取pGEX-4T1原核表達(dá)載體，大腸桿菌菌株BL21（DE3）和DH5α由中南民族大學(xué)國家民委生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑及工具酶

凝膠回收試劑盒、凝膠清潔試劑盒與反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Axygen公司；Pageruler？誖Prestained 預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker購自Frementas公司；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ、T4 DNA連接酶、rTaq酶、DNA分子質(zhì)量Marker均購自Takara公司。

1.3 水稻RNA的提取

分別稱取100 mg水稻粵泰A的葉片，放入已經(jīng)處理好的研缽中，加入液氮研磨至完全粉末狀，加1 mL Trizol，繼續(xù)研磨，直到均一相液體，轉(zhuǎn)至無RNase的1.5 mL 離心管中。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液至新管中后室溫放置5 min。加入0.2 mL氯仿，振蕩混勻15 s后室溫放置3 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。取最上層水相轉(zhuǎn)移至新管，體積大約為起始加入Trizol體積的60%。往水相里加入0.25 mL異丙醇及0.25 mL濃鹽沉淀液（0.8 mol/L檸檬酸鈉和1.2 mol/L NaCl）以沉淀RNA。混勻后室溫放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min， RNA沉淀于管底。加入1 mL 75%乙醇， 溫和振蕩離心管， 懸浮沉淀。 4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，盡量棄上清。超凈臺(tái)上室溫干燥20 min左右，用20 μL RNase-free H2O溶解RNA，振蕩30 s，稍離心。使用變性膠進(jìn)行電泳， 以防止RNA的降解。然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)得到cDNA。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系： RNase Free H2O 1 μL，5× RT buffer 4 μL，Random Primer （25 pmol/μL） 1 μL， RNase Inhibitor （10 U/μL） 1 μL，dNTP Mixture（各10 mmol/L） 2 μL， RNA 10 μL，ReverTra Ace 1 μL。反應(yīng)程序：30 ℃ 10 min， 42 ℃， 20 min， 99 ℃ 5 min， 4 ℃ 5 min。

1.4 OsRPL2基因的擴(kuò)增

根據(jù)水稻OsRPL2蛋白質(zhì)在NCBI的nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列（序列號(hào)：YP_002000581設(shè)計(jì)出RPL2-CDS的引物，引物序列RPL2-F：5′-ATGAGACAAAGCATAAAGGG-3′；RPL2-R：5′-AATTCTGCGTTTCCCCAC-3′。

采用10 μL體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液1.0 μL，RPL2-F（10 μmol/L） 0.2 μL，RPL2-R（10 μmol/L） 0.2 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 0.8 μL，模板cDNA 1.0 μL，rTaq酶（5 U/μL） 0.1 μL，H2O 6.7 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 序列分析

使用NCBI 網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）序列比對軟件blastn、blastp程序及功能域分析軟件Conserved Domain Search Service （CD Search）程序和瑞士生物學(xué)信息研究所網(wǎng)站ExPASy的Protscale程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性分析。

1.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)RPL2-CDS的引物，引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出目的片段，PCR引物序列：RPL2-CDS-F： 5′-CGCGGATCCATGAGACAAAGCATAAAGGG-3′；RPL2-CDS-R：5′-CCGCTCGAGAATTCTGCGTTTCCCCAC-3′。

反應(yīng)體系、程序及檢測同“1.4”。

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ同時(shí)雙酶切目的片段和pGEX-4T1空載體，37 ℃酶切過夜，使用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收和清潔回收目的片段及載體片段。16 ℃用T4 DNA連接酶連接RPL2-CDs的目的片段和pGEX-4T1載體片段7 h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂Amp+平板后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。從平板上隨機(jī)挑取單克隆，提取質(zhì)粒并且進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的單克隆送去測序。

1.7 重組蛋白質(zhì)的原核表達(dá)

1.7.1 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo) 用重組質(zhì)粒pGEX-4T1-RPL2轉(zhuǎn)化BL21菌株，涂Amp+平板后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆單菌落，接種于5 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶1 000的接種量進(jìn)行接種，吸取約250 μL菌液接種于250 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6。加入0.7 mol/L IPTG至終濃度為0.7 mmol/L。于17 ℃和37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。同時(shí)，誘導(dǎo)不加IPTG的pGEX-4T1-RPL2和pGEX-4T1空載體的BL21菌株作為陰性對照。

1.7.2 重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE檢測 將誘導(dǎo)表達(dá)完成的菌液轉(zhuǎn)入離心管中，4 000 r/min離心10 min，倒盡上清液，收集菌體，加入3 mL預(yù)冷 PBS（pH 7.4）緩沖液，緩慢用槍頭吹打菌體使菌體重新懸浮，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎細(xì)胞，破碎10 s，間隔10 s，每管破碎15 min，此時(shí)收集蛋白質(zhì)混合液。在4 ℃、4 000 r/min離心15 min，分別收集蛋白質(zhì)上清和沉淀。在各個(gè)取樣中分別加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液并混合均勻，沸水中煮15 min，進(jìn)行10 % SDS-PAGE檢測。恒壓100 V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑電泳至膠底部邊緣或略微冒出時(shí)即可停止電泳（大約2.5 h）。用考馬斯亮藍(lán)染色液染色3 h后用脫色液進(jìn)行脫色。

1.7.3 重組蛋白質(zhì)表達(dá)的Western blot檢測 將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)用10% SDS-PAGE膠電泳至溴酚藍(lán)指示劑電泳至膠底部邊緣，電轉(zhuǎn)儀橫流80 mA 轉(zhuǎn)膜3 h，使蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素薄膜上，先用40 mL封閉液室溫靜置封閉1 h，按1∶15 000的比例在封閉液中加入GST一抗，在4 ℃環(huán)境下振蕩封閉過夜，按1∶10 000的比例加入二抗羊抗兔至封閉液中，放入孵育箱內(nèi)28 ℃振蕩孵育封閉1 h后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻總RNA的提取和OsRPL2基因的克隆

用Trizol從水稻粵泰A的葉片中提取RNA，瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示提取的RNA效果良好（圖1）。根據(jù)檢測的RNA濃度利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

利用設(shè)計(jì)好的OsRPL2基因CDS上下游引物通過PCR程序從水稻cDNA中擴(kuò)增目的條帶，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，結(jié)果（圖2）表明獲得了與預(yù)期片段大小相符的清晰的目的條帶。將該片段進(jìn)行TA克隆及測序，測序結(jié)果表明克隆得到的水稻OsRPL2基因與GenBank中序列一致，說明獲得的OsRPL2基因是正確的。

2.2 水稻OsRPL2基因及蛋白質(zhì)的序列分析

根據(jù)克隆得到水稻核糖體蛋白質(zhì)基因OsRPL2的cDNA序列，分析得到OsRPL2基因的cDNA全長為1 570 bp，其編碼的蛋白質(zhì)含有502個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)大小為54.9 ku（圖3）。

將OsRPL2基因序列與不同植物來源的編碼核糖體蛋白質(zhì)L2的基因進(jìn)行了同源性比較，發(fā)現(xiàn)它與同屬禾本科的粟米核糖體蛋白質(zhì)L2基因的同源性最高，基因序列的相似性達(dá)到了95%，而與芭蕉科的野芭蕉核糖體蛋白質(zhì)L2基因及茄科的番茄核糖體蛋白質(zhì)L2基因的相似性都達(dá)到87%。但水稻OsRPL2基因序列與非植物類別的真核生物核糖體蛋白質(zhì)L2基因不具有明顯的相似性，說明水稻OsRPL2基因是一種進(jìn)化上較為保守的基因。

對水稻OsRPL2蛋白質(zhì)序列使用蛋白質(zhì)功能域分析軟件CD Search進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)OsRPL2蛋白質(zhì)具有2個(gè)明確的功能域（圖4），分別是第22～80個(gè)氨基酸的RNA binding功能域和第359～486個(gè)氨基酸的C-terminal domain功能域。同時(shí)為了獲得可溶性的外源表達(dá)OsRPL2蛋白質(zhì)，使用瑞士生物學(xué)信息研究所提供的Protscale程序進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性分析，結(jié)果表明水稻OsRPL2蛋白質(zhì)是部分可溶性蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)pI為10.87。這些為進(jìn)一步獲得外源表達(dá)的可溶性O(shè)sRPL2蛋白質(zhì)提供了幫助和借鑒。

2.3 水稻OsRPL2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將水稻OsRPL2基因通過BamHⅠ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T1上，通過PCR鑒定，目的片段大小為1 570 bp；另外，通過雙酶切鑒定顯示，構(gòu)建完成的載體經(jīng)過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到大小分別為5 000 bp和1 570 bp的條帶，與預(yù)期估計(jì)條帶大小相同。將構(gòu)建好的載體送生物公司測序，其測序結(jié)果100%匹配，成功構(gòu)建了帶有GST標(biāo)簽的陽性重組表達(dá)質(zhì)粒（圖5）。

2.4 重組蛋白質(zhì)表達(dá)的SDS-PAGE檢測結(jié)果

將陽性重組質(zhì)粒點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化入BL21表達(dá)菌株，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，將誘導(dǎo)表達(dá)的pGEX-4T1-RPL2細(xì)菌菌體收集后用遇冷的PBS重懸，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎。用10% SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色，17 ℃和37 ℃均可觀察到在70～100 ku間誘導(dǎo)處理后的樣品與pGEX-4T1空載和未經(jīng)誘導(dǎo)的pGEX-4T1-RPL2蛋白質(zhì)樣品存在明顯的特異蛋白質(zhì)，其大小與預(yù)測的OsRPL2蛋白質(zhì)產(chǎn)物大小相同，且在混合液和上清中均有目的蛋白質(zhì)（圖6），表明OsRPL2基因在pGEX-4T1系統(tǒng)中得到了高效表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物為部分可溶性蛋白質(zhì)。

2.5 重組蛋白質(zhì)表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

用GST單抗對誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)孵育進(jìn)行檢測，可以觀察到蛋白質(zhì)大小為70～100 ku，誘導(dǎo)處理后的pGEX-4T1-RPL2沉淀、上清和混合中均出現(xiàn)單一的信號(hào)條帶，而未加IPTG誘導(dǎo)的pGEX-4T1-RPL2和空載體的蛋白樣品中未見信號(hào)表達(dá)（圖7）。此結(jié)果進(jìn)一步表明載體構(gòu)建成功，水稻OsRPL2蛋白質(zhì)成功并高效表達(dá)，并且該外源蛋白質(zhì)可以得到可溶性和包涵體兩種表達(dá)形式。

3 討論

目前有一系列關(guān)于核糖體蛋白質(zhì)的報(bào)道與研究[5-8]，核糖體廣泛的存在于高等生物的葉綠體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)生物體需要大量的核糖體蛋白質(zhì)來組裝成為核糖體，才能為正常的生命活動(dòng)提供保障[7]。由此可見核糖體蛋白質(zhì)是核糖體的重要組成部分，許多的核糖體蛋白質(zhì)不僅結(jié)構(gòu)上具有功能，同時(shí)也是翻譯過程中必不可少的因子，對細(xì)胞的增殖、分裂及分化起到重要的調(diào)節(jié)作用[4]。顧志敏等[10]首次從單子葉的模式植物水稻中克隆了核糖體蛋白質(zhì)S7基因，證明了核糖體蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中的高度保守性。Yao等[11]成功分離了小麥中的15個(gè)核糖體蛋白質(zhì)基因，并分析了其序列特性并進(jìn)行了表達(dá)模式的檢測。

本研究的OsRPL2基因是一個(gè)水稻核糖體蛋白質(zhì)基因，其來源于武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的前期研究，由構(gòu)建的水稻粵泰A品種cDNA文庫鑒定得到。為了進(jìn)一步研究其功能及作用機(jī)理，作者提取了水稻粵泰A品種的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA并進(jìn)一步擴(kuò)增獲得了OsRPL2基因的cDNA序列。根據(jù)序列分析的結(jié)果，水稻OsRPL2基因與多個(gè)植物核糖體蛋白質(zhì)L2基因具有較高的相似性并具有較高的保守性，這點(diǎn)和其他已經(jīng)報(bào)道過的水稻核糖體蛋白質(zhì)基因相似[12]。同時(shí)其編碼的OsRPL2蛋白質(zhì)具有2個(gè)與核糖體蛋白質(zhì)功能相關(guān)的功能域，為進(jìn)一步的功能分析提供了線索和幫助。在此基礎(chǔ)上，以O(shè)sRPL2基因的cDNA序列為模板成功構(gòu)建了pGEX-4T1-RPL2的原核表達(dá)載體，并通過考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot檢測證實(shí)了通過IPTG誘導(dǎo)，核糖體蛋白質(zhì)OsRPL2在混合液、上清及沉淀中均有表達(dá)，說明了其為部分可溶性蛋白質(zhì)。因此本研究的結(jié)果為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，可以更加深入地探究核糖體OsRPL2基因的功能和作用。

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