肝癌細胞株中VEGFR活化檢測及臨床意義

劉 斌 高建東 劉 清

肝癌細胞株中VEGFR活化檢測及臨床意義

劉 斌 高建東 劉 清

目的 探討血管內皮細胞生長因子受體(VEGFR)活化檢測在肺癌診治中的應用價值。方法 應用Western Blot法檢測HepG2、QGY-7701、SMMC-7721、MHCC97-H和HCCLM3這5種人肝癌細胞株的VEGFR表達及活化前后的含量變化。結果 5種人肝癌細胞株的VEGFR均呈陽性表達，活化后鋅指轉錄因子Snail、Slug和Twist含量顯著高于活化前，差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論 人肝細胞癌組織中存在VEGFR表達，可以作為肝癌發生發展的一種重要的動態監測指標, VEGFR活化促進肝細胞癌侵襲轉移，鋅指轉錄因子是干預肝細胞癌侵襲轉移的有效靶點。

血管內皮生長因子；肝癌細胞；活化檢測；臨床診斷

由于血管生成能夠促進腫瘤的發展和轉移，研究[1-2]表明，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為一種重要的刺激因子，在腫瘤血管的形成過程中發揮著非常重要的作用，而VEGF的2個特異性受體VEGFR-1(Flt-1)及VEGFR-2(KDR)活化都能體現癌細胞侵襲和轉移的生物學效應。肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是含血管最豐富的一種的惡性腫瘤，其VEGF表達必然能提示腫瘤的生長、浸潤和轉移狀況[3]。為探尋肝癌基因治療中最有效的作用靶點，本研究進行肝癌細胞株的VEGFR蛋白含量及活化前后Snail、Slug、Twist蛋白表達變化的檢測，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 5株人肝癌細胞株均購自上海鑫閔生命科學有限公司，分別是上皮樣人肝癌細胞HepG2、QGY-7701和SMMC-7721 HHCC，高轉移肝癌細胞HCCLM3和MHCC97-H。細胞培養基RPM-1640購自美國Gibco公司，小牛血清購自上海萬疆生物技術有限公司，SDS-PAGE凝膠、蛋白上樣緩沖液、電泳液均購自北京賽馳生物公司，兔抗人VEGFD多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，人VEGF檢測試劑盒購于上海嵐派生物公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 細胞培養 將5種待檢人肝癌細胞株置于含有10%小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的RPM-1640培養基中生長，孵箱溫度控制在37℃，飽和濕度5% CO，細胞長至80%培養皿面積時，以0.125%胰酶消化1min，倒去胰酶，加入新鮮培養基，用單去污劑裂解液裂解細胞。

1.2.2 濃度測定 取對數生長期細胞制成細胞數為5×106/mL的細胞懸液，接種96孔板，加入含不同濃度的VEGF-B培養基。分別用MTT法，以VEGF-Bong/mL的吸光值進行校正，確定VEGF-B濃度為lng/mL是適宜肝癌細胞株的生長[2]。

1.2.3 檢測蛋白 (1)電泳：蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，先以100℃沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。然后冷卻到室溫后，把30μg蛋白樣品加入12.5%SDS凝膠加樣孔內，用100V恒壓在SDSPAGE電泳液中電泳90～120min，至蛋白被適當分離后即停止電泳。(2)轉膜：用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置(電流為300～400mA)轉膜30～60min。(3)封閉：轉膜完畢后將蛋白膜放置到Western洗滌液中，漂洗1～2min，真空泵吸盡洗滌液后加入Western封閉液，在室溫下封閉60min。(4)一抗孵育：將兔抗人VEGFD多克隆抗體以稀釋液按1∶400比例稀釋后，將蛋白樣品置入其中，在4℃溫度下孵育過夜。(5)二抗孵育：將羊抗兔IgG-HRP按1∶2000稀釋后在室溫或4℃溫度下，在側擺搖床上緩慢搖動孵育60min。(6)蛋白檢測：使用BeyoECL Plus顯影，用凝膠成像系統掃描各條帶灰度值進行半定量分析。以酶標儀測吸光度似值，根據標準品A值求出標準曲線方程。計算出細胞上清中VEGFR濃度。

1.3 統計學方法 對本組研究的數據采用SPSS18.0統計軟件進行分析。計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGFR蛋白含量 5株人肝癌細胞培養上清液中都檢測出VEGF蛋白，以HCCLM3含量最高，達到(741.5±42.8) pg/mL，其余依次為MHCC97-H、SMMC-7721和HepG2，含量分別為(636.4±25.1)、(582.6±18.7)和(540.8±19.2)pg/mL，QGY-7701含量最低，僅為(487.5±13.7)pg，其中，VEGFR-1(Flt-1)在HCCLM3、SMMC-7721、HepG2和MHCC97-H這4種人肝癌細胞株中都呈陽性表達，VEGFR-2(KDR)在HCCLM3、QGY-7701、MHCC97-H和HepG2也呈陽性表達，陽性物質分布在胞膜及胞漿上，為棕黃色。只有QGY-7701和SMMC-7721分別在Flt-1和KDR中為陰性表達。

2.2 肝癌細胞株中VEGFR活化前后鋅指轉錄因子含量變化 無論是Flt-11還是KDR，活化后鋅指轉錄因子Snail、Slug和Twist的含量前均顯著高于活化前(P＜0.05)。見表1。

表1 5種肝癌細胞株VEGFR活化前后鋅指轉錄因子含量比較±s,pg/mL)

表1 5種肝癌細胞株VEGFR活化前后鋅指轉錄因子含量比較±s,pg/mL)

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由表1可以看出，5種肝癌細胞株的受體VEGFR話化后，鋅指轉錄因子Snail、Slug和Twist的表達均較活化前明顯增加，提示VEGFR活化促進肝細胞癌侵襲轉移，鋅指轉錄因子是干預肝細胞癌侵襲轉移的有效靶點。

3 討論

研究[2-4]證實，腫瘤在形成、浸潤與轉移過程中，新生血管形成發揮了非常關鍵的重要作用，VEGFR不僅表達在血管內皮細胞中，而且在乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、結腸癌和胰腺癌等許多實體腫瘤細胞表達增強和不斷分泌時，VEGF含量也會顯著增加，這一特點在含血管最豐富的肝癌中最為突出，臨床檢測證實，幾乎所有肺癌患者血清的VEGF含量都顯著高于健康人群。目前，對肝癌細胞如何突破基底膜侵襲鄰近組織，并逐漸向遠處轉移的機理并不十分清楚，但新生血管生成直接受到血管生成因子調控，因VEGF具有促進血管生成和增加血管通透性的功能，能刺激血管內皮細胞增殖和毛細血管袢的形成，血管新生為腫瘤的生長提供了血供，間質為腫瘤生長提供了適宜的環境，從而為肝癌的侵襲和轉移創造條件是必然的[5]。本研究對5種不同的肝癌細胞株進行VEGFR檢測，結果發現，所有肝癌細胞株都存在VEGFR表達，并且都集中在上皮樣HCC中，尤以高轉移肝癌細胞HCCLM3和MHCC97-H含量最高，雖然對其中的原理并不清楚，但足以證實HCC能分泌大量的血管生成因子，以VEGFR檢測來診斷肝癌的敏感性和特異性都顯著高于文獻[1]中報道的其它惡性腫瘤，因此，VEGFR表達可以作為肝癌發生發展的一種重要的動態監測指標。

在VEGF的2個特異性受體中，目前對VEGFR-1被激活能促進癌細胞侵襲和遷移的研究較多，但對VEGFR-2活化后是否也促進癌細胞侵襲和遷移還存在爭議，且激活VEGFR在肝癌的發生、發展和侵襲轉移中發揮作用的具體機制認識也并不統一，其中VEGFR-1被認為是一種激酶損傷的受體酪氨酸激酶，VEGFR-1能夠通過誘導EMT而促進肝癌侵襲和轉移，許多不同的細胞外刺激因子能啟動EMT和相應的細胞形態學改變已形成共識[5-6]。本研究發現，鋅指轉錄因子Snail、Slug和Twist的表達在VEGFR-1和VEGFR-2活化后明顯上調，說明VEGFR活化在肝癌轉移和侵襲中發揮了很大作用，這正是由于VEGFR活化誘導肝癌細胞株發生EMT，從而增加癌細胞侵襲和轉移能力，當然指轉錄因子Snail、Slug和Twist如何誘導EMT發生，Snail的機制還有待進一步研究。

治療HCC是一個非常棘手的問題，目前多以控制轉移和復發作為提高效果的途徑。從這個意義上說，了解肝癌細胞如何獲得侵襲轉移潛能有很大臨床實用價值。檢測VEGFR活化后的含量是為了抑制肝癌細胞的VEGF/VEGFR。一方面，肝癌中很可能存在VEGF自分泌作用途徑，通過抑制血管新生能抑制腫瘤生長，促進腫瘤細胞凋亡[7]；另一方面，可將VEGFR作為肝癌治療的一個新的靶點，或通過構建Src尋找VEGFR——EMT信號轉導通路，為治療肝癌侵襲和轉移尋找新的作用靶點，這可以為尋找肝癌的治療探尋一個新的思路[8]。

總之，VEGFR能促進血管內皮細胞的分化和生長，在肺癌新生血管的發生、發展過程中具有重要作用，可以作為肝癌發生、發展和治療效果的一種重要動態監測指標,VEGFR活化促進肝細胞癌侵襲轉移，鋅指轉錄因子是干預肝細胞癌侵襲轉移的有效靶點。VEGFR活化檢測對肺癌治療及預后所產生的作用還可進一步研究和探討。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.19.007

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