龜齡集膠囊對弱精子癥精子線粒體功能的作用機制研究

孫中明吳燕紅 周海港 姜語彥 許哲杰嵊泗縣人民醫院泌尿科（浙江嵊泗 202450）

龜齡集膠囊對弱精子癥精子線粒體功能的作用機制研究

孫中明*吳燕紅 周海港 姜語彥 許哲杰
嵊泗縣人民醫院泌尿科（浙江嵊泗 202450）

摘要目的 觀察龜齡集膠囊對特發性弱精子癥精子線粒體的作用，探討龜齡集膠囊治療特發性弱精子癥的機制。方法 根據特發性弱精子癥診斷標準，篩選特發性弱精子癥且中醫辨證屬腎陽虛的患者253例為治療組，根據前向運動（A級+B級）精子的百分率分成3組：35%≤A組＜50%、20%≤B組＜35%、C組＜20%；選取61名正常生育男性為空白對照組。A、B、C組均用龜齡集膠囊治療，每次0.6 g，每日2次，4個月為一個療程。對各組精子治療前后均作精子線粒體功能檢測和精液分析，并觀察各組精子密度、精子活力、精子線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）、線粒體膜電位（MMP）治療前后的變化。結果 （1）各組治療后線粒體功能SDH、MMP改善，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（2）各組前向運動精子活力均有明顯提高（P＜0.01）。結論 龜齡集膠囊能有效改善特發性弱精子癥精子活力，其機制是改善精子線粒體琥珀酸脫氫酶和線粒體膜電位，從而提高了線粒體的功能。

關鍵詞弱精子癥; 琥珀酸脫氫酶; 膜電位,線粒體; 精子能動性; 龜齡集

特發性弱精子癥是指患者通過男性不育相關常規檢查及精液分析后發現除精子活力低下外，其他未發現影響男性生育的因素，而且也找不到明確的精子活力低下的病因?；颊吲R床上也無明顯癥狀和體征[1, 2]。目前特發性弱精子癥的精子線粒體功能病變的原因及機制不明，中西醫治療上均缺乏針對性。我們在用龜齡集膠囊治療中醫辯證腎陽虛虧型特發性弱精子癥時，發現其改善精子線粒體功能和活力方面有明顯效果。

資料與方法

一、一般資料

選取2012年1月至2014年3月來我院就診的特發性弱精子癥患者253例作為治療組，且中醫辨證為腎陽虛損證型。根據（A級+B級）精子的百分率分成3組： 35%≤A組＜50%、20%≤B組＜35%、C組＜20%；其中A組80例，B組89例，C組84例。病程均在4～10年，各組平均年齡分別為A組（34.3±2.4）歲，B組（33.9±2.5）歲，C組（34.7±2.2）歲。各組在年齡、病程方面無統計學意義（P＞0.05）。選取1名已生育正常嬰兒的男性且相關項目體檢健康者作為空白對照組，平均年齡（33.1±2.5）歲。該組作精液分析和精子線粒體的功能檢測，不服用藥物。

二、診斷標準

不孕不育診斷參照《男性不育癥診斷與治療》[3]及《人類精子學》[4]：（1）正常育齡青年婚后1年或以上，性生活正常，未避孕，至今不育；（2）排除下列具有影響男性生殖的肯定病因：醫源性因素、全身性病因、先天性異常、后天性睪丸損害、精索靜脈曲張、男性附屬性腺感染、血內分泌激素（生殖激素6項、甲狀腺功能、皮質醇等）、染色體異常等；（3）精液分析精子密度≥20×106/mL而快速前向運動的精子A級＜25%和前向運動（A級＋B級）精子＜50%。

腎陽虛證診斷參照《實用中西醫結合泌尿男科學》[5]、《實用中西醫結合不孕不育診療學》[6]、《男科疾病中西醫匯通》[7]、《腎陽虛證癥狀表現規律的臨床研究》[8]和《對腎陽虛證診斷標準層次性的探討》[9]：（1）夫妻婚后1年或以上，性生活正常，未避孕，女方未曾孕育；（2）精液分析用偉力精液分析系統連續分析兩次以上，選擇除精子活力、活率異常外，其他未發現異常的不育患者，從中選擇A級精子＜25%和（A級＋B級）精子＜50%的患者。（3）腎陽虛證的診斷標準：腰酸膝軟，畏寒肢冷，面色白，夜尿頻多，小便清長，大便溏薄，兼有神疲乏力，頭暈，形寒，性欲淡漠，四肢不溫，腰痛，陽痿等證候中的2項。舌淡，舌胖邊有齒痕，苔薄白。脈沉細，或脈弱，或遲無力。（4）特發性弱精子癥患者找不到明確病因。

三、納入及排除標準

（一）納入標準

（1）符合診斷標準；（2）治療前6個月內未使用針對該病癥的中西藥及其他治療方法；（3）女方檢查均正常。

（二）排除標準

（1）配偶有不孕疾患；（2）性生活不正常，逆行射精或不射精等；（3）服用抗癲癇病、抗腫瘤等有礙生精及精子活力的藥物者；（4）男方生殖系統先天畸形，精路梗阻，睪丸萎縮，精索靜脈曲張Ⅱ級以上患者；（5）對本藥過敏者；（6）合并心血管、肝、腎和造血系統等嚴重原發性疾病，精神病患者；（7）就診半年內使用性激素等西藥治療或長期服用各類補腎中藥達2個月以上者；（8）不符合納入標準，未按規定用藥，無法判斷療效或資料不全等影響療效和安全性判斷者。

四、方法與觀察指標

（一）藥物、試劑和儀器

線粒體膜電位檢測試劑盒系美國Biomet公司產；FeSO4購自天津市福晨化學試劑廠；H2O2系美國Sigma公司產；MHTF（Modifi ed HTF Medium）購自美國OVEN公司；FACS Caliber型流式細胞儀系美國BD公司產；DMAR2型熒光顯微鏡系德國LEICA公司產；LDZ5-2離心機由北京醫用離心機廠提供；電熱恒溫水浴鍋系北京市醫療設備廠產。精液分析用偉力計算機輔助精液分析系統（WLJY-9000）并配備恒溫裝置。

（二）方法

精液分析根據WHO的標準，隔5d連續分析二次以上，除精子活力、活率異常外，選擇其他未發現異常的不育患者533例。從中選擇中醫辯證腎陽虛的患者且A級精子＜25%和前向運動（A級＋B級）精子＜50% 的共計253例，因為精子活力與精子線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）、線粒體膜電位（MMP）密切相關，所以根據（A級＋B級）精子百分率以小于50%、35%、20%為界限，分成三組。正常對照組：選擇婚后2年已正常生育過健康嬰兒且無不良嗜好的男性，精液分析及相關項目檢查正常的志愿者61例作為空白對照組。同時作精液分析和檢測精子線粒體功能。用藥方法：正?？瞻讓φ战M不服用藥物、A、B、C組均用龜齡集膠囊（山西廣譽遠國藥有限公司，國藥準字Z14020687，規格：0.3g×30粒）。0.6g，Bid。4個月為一個療程，共二個療程。治療期間禁煙酒，生活規律。

（三）觀察指標

（1）治療前后均檢測精子密度與A級精子活力。（2）精子線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）檢測：采用NBT法并參照文獻[10, 11]介紹的方法進行精子線粒體SDH檢測。精子尾中段（線粒體所在部位）有藍色顆粒沉著，即為精子SDH性，在高倍鏡下觀察10個視野，共計數100個精子，計算正常著色精子數量。生育男性正常著色線粒體精子＞70%。（3）精子線粒體膜電位（MMP）檢測：參照文獻[12-14]用熒光探針JC-1檢測精子線粒體膜電位，熒光顯微鏡下JC-1染色的精子形態 精子尾中段部即線粒體所在部位著色明亮。精子對JC-1的攝取依賴于跨膜電位，線粒體膜電位低，呈現綠色熒光。正常精子的線粒體膜電位高，呈現紅色熒光。正常呈現紅色熒光線粒體精子＞70%。各組分別治療4個月為1個療程，對照組和治療組均在治療前后分別作精液分析、精子線粒體功能檢測。

五、統計學分析

應用SPSS11.0統計軟件分析，計量資料以x±s表示，用單因素方差檢驗。計數資料采用列聯表資料的卡方（x2）檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、治療前后各組精液分析比較

A、B、C組治療前后比較精子密度差異有統計學意義（P＜0.01）。治療后各組間精子密度比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A、B、C組治療后前向運動（A級+B級）精子活力均提高，與治療前比較差異有統計學意義（P＜0.01）。治療后各組間前向運動精子活力比較： C組與正常組、A組、B組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。B組與正常組、A組差異比較有統計學意義（P＜0.01）。A組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。龜齡集膠囊能有效改善特發性弱精子癥前向運動（A級+B級）精子活力和密度，見表1。

表1 各組治療前后精子相關參數的影響

二、治療前后線粒體功能結果比較

各組治療前隨著精子活力的下降，線粒體正常著色精子數呈現出下降趨勢（SDH、MMP的正常率下降）。治療后線粒體正常著色精子數呈現上升趨勢（SDH、MMP的正常率上升）。除正常組治療前后線粒體功能的差別比較無統計學意義（P＞0.05）外，其他各組治療前后線粒體功能差別的比較均有統計學意義（P＜0.01）。治療后各組間比較：C組與A、B、正常組線粒體功能差別比較有統計學意義（P＜0.05）；A、B、正常組相互間線粒體功能差別比較無統計學意義（P＜0.05）。治療后線粒體正常著色精子數（SDH、MMP的正常率）的上升，精子活力也隨著上升，精子線粒體功能與精子活力成正相關，見表2。

表 2 各組精子線粒體功能比較（xx±ss,, %%）

討 論

在弱精子癥中有10.9%為特發性弱精子癥[8]。精子動力低下的原因有：（1）外因：精子抗體陽性、解脲支原體陽性 、前列腺炎、血性激素異常等，這些均是外界存在影響精子動力的因素。（2）內因如：最常見的問題是精子尾超微動力裝置結構性病變和功能發生異常，如線粒體病變：堆積、小線粒體、大線粒體、囊性化、融合、移位、缺損；軸絲病變：周圍軸絲缺損、周圍軸絲排列紊亂、中央軸絲排列紊亂等；致密纖維病變：左右排列紊亂、密纖維缺損等，這些均是精子本身內在動力系統病變。精液分析是分析精子運動的物理參數，不能表明精子運動障礙的原因。至于精子尾部結構的病變導致運動障礙首先需要作相關功能檢測和超微檢查，如線粒體功能檢測和形態檢查[10, 11]。

在弱精子癥和死精子癥中，可見大量線粒體缺陷的存在。琥珀酸脫氫酶（SDH）是線粒體標志酶之一，其活性的降低可影響精子能量代謝，造成精子運動能力下降。SDH可將琥珀酸氧化生成延胡索酸，脫下的H+通過中間氫受體吩嗪甲基硫酸酯（PMS）將硝基四氮唑藍還原為二甲月替，呈藍紫色顆粒[12]。

線粒體是精子運動能量提供的場所。其功能狀況直接決定了精子的運動能力，特別是與受精密切相關的前向運動能力。線粒體是精子呼吸的主要場所。通過氧化磷酸化作用合成ATP，為精子的運動提供能量，而ATP合成過程與線粒體內的電子傳遞有關。線粒體通過電子傳遞將H+從基質泵至膜間隙，在線粒體內側形成跨膜的線粒體膜電位，推動ATP合成酶合成TP供精子生命活動所需。線粒體膜電位的維持對于線粒體正常功能的實現極其重要，膜電位的下降會導致ATP合成不足，影響細胞正常的生命活動。線粒體膜電位反應了精子的能量代謝水平，線粒體膜電位的喪失可導致精子細胞凋亡與壞死。因此，通過檢測線粒體膜電位的變化，有助于了解線粒體的功能變化[13]。

線粒體的功能狀態對精子存活起著重要作用，因為精子的運動能力與線粒體的活性密切相關，整個精子代謝所需的能量主要由線粒體提供。線粒體活性的改變會影響精子的能量供應，且研究表明，線粒體還是細胞凋亡的調控中樞。因此，線粒體的功能狀態是了解精子功能質量的一個關鍵性指標[14-18]。本文研究結果表明：隨著治療后線粒體SDH、MMP正常率的上升，精子活力也隨著上升，精子線粒體功能與精子活力成正相關。線粒體的功能狀態在中醫屬于腎陽、腎精、元陽范疇。如能補益線粒體的“陽氣”則能提高精子活力。

中藥龜齡集膠囊起源于明代。有方士邵元節據“云籍上筏”的增刪而取名，方由人參、鹿茸、海馬、枸杞子、丁香、穿山甲、雀腦、牛膝、鎖陽、熟地黃、補骨脂、菟絲子、杜仲、石燕、肉蓯蓉、甘草、天冬、淫羊藿、大青鹽、砂仁等28味中藥組成，能強身補腦，固腎補氣，增進食欲。用于腎虧陽弱，記憶減退，夜夢精溢，腰酸腿軟，氣虛咳嗽，五更溏瀉，食欲不振。中醫學認為具有溫腎助陽、大補真元的功效。多用于治療命門火衰、腎精不足及氣血虧損引起的陽痿及遺精[19]。能增強下丘腦-垂體-性腺軸及腎上腺皮質軸等內分泌系統的分泌功能，其提取液能影響“陽痿”模型小鼠DNA的合成，同時對體外精子的各種運動參數有明顯促進作用。對活性氧所致的精子損傷有拮抗作用，促使腺體保持年輕水平，其中人參有大補元氣和補脾腎的作用；增強性腺機能，有促進性腺激素作用，在細胞培養中細胞數明顯增多，細胞生長旺盛壽命延長，其提取液能提高精子的運動速度。鹿茸可以溫養督脈、生精益髓。鎖陽、枸杞子、肉蓯蓉、淫羊藿等有滋腎陰，補腎陽，陽中求陰、陰中求陽，益氣強精的功效。砂仁宣通三焦氣機，醒脾和胃，補后天以助先天，既免除補腎滋膩礙胃之弊，又可引諸藥歸腎，能收斂固澀、益氣生津、補腎寧心[20-26]。精子發生的周期為3個月，由于中藥的起效需要一個積累過程，所以該治療4個月為一個療程，共2個療程，以充分有效發揮中藥的作用。

上述研究發現龜齡集膠囊能有效改善精子尾線粒體SDH、MMP的正常率，正常著色精子數上升，精子活力也隨著上升。其機制是改善線粒體功能相關病變引起的精子運動障礙導致的活力低下，從而起到補益線粒體“陽氣”的作用。其具體的詳細的作用步驟或機制環節還有待進一步研究。

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（2014-03-08收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.008

中圖分類號R 698.2

*通訊作者, Tel: 18058069031; E-mail: 1104858603@qq.com

Study on Guilinji Capsule for mitochondria function of sperm in idiopathic asthenospermia

Sun Zhongming*, Wu Yanhong, Zou Hangang, Jiang Yuyan, XuZhejie
Zhejiang Shenshi Hospital, Shenshi 202450, Zhe Jiang, China
Corresponding author: Sun Zhongming, Tel: 18058069031; E-mail: 1104858603@qq.com

AbstractObjective To study the effect of Guilinji capsule on mitochondria function of sperm tail in idiopathic asthenospermia and explore its mechanism. Methodsthods According to the diagnosing standard of idiopathic asthenospermia and A and B level sperm viability, 253cases with idiopathic asthenospermia were divided into 3 groups, 35%≤A＜50%, 20%≤B＜35%, C＜20%, and treated with Guilinji capsule 0.6g, Bid. four months for one period of treatment. Seminal fl uid analysis and mitochondria function examination were carried out before and after treatment. Sperm density,viability,SDH and MMP were comparatively analzed. Resultssults There was a more significant improvement in mitochondria function (SDH、MMP) (P＜0.01)and sperm viability of each group after treatment (P＜0.01). Conclusionusion Guilinji capsule signifi cantly improvement in mitochondria function of sperm in idiopathic asthenospermia and level of sperm viability.

Key wordsords asthenozoospermia; succinate dehydrogenase; membrane potential, mitochondrial; sperm motility; Guilinji capsule