體外誘導小鼠骨髓CD45—細胞向竇房結起搏樣細胞定向分化

溫昱 李彬

[摘要] 目的 探討體外誘導小鼠骨髓CD45-細胞向竇房結起搏樣細胞定向分化的方法。 方法 免疫磁珠分選小鼠骨髓CD45-細胞，體外培養擴增后，采用添加了5-氮胞苷和小鼠竇房結組織培養上清液的誘導培養基培養，經免疫熒光染色檢測起搏樣細胞標志物神經絲蛋白-160（NF-160）和超級化激活環核苷酸門控陽離子通道（HCN）4表達，并采用qRT-PCR定量檢測起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達。 結果 小鼠骨髓CD45-細胞經體外誘導培養后得到的分化細胞表達NF-160和HCN4；qRT-PCR分析顯示，與體外培養的小鼠竇房結細胞比較，分化起搏樣細胞NF-160和HCN4的表達升高，HCN2的表達降低。 結論 體外培養能夠將小鼠骨髓CD45-細胞誘導分化為竇房結起搏樣細胞，為構建生物起搏器種子細胞提供選擇。

[關鍵詞] 起搏樣細胞；CD45；HCN4；NF-160；竇房結

[中圖分類號] R329.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（b）-0009-04

Inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro

WEN Yu1 LI Bin2

1.Department of Histology & Embryology， Basic Medical College of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110122， China； 2.Department of Sports Medicine， Affiliated Shengjing Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110022， China

[Abstract] Objective To study method on inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro. Methods Mouse bone marrow CD45-cells were derived by using immunomagnetic beads system. After amplification in vitro， induced medium supplemented with 5-azacytidine and culture supernatant liquid of mouse sinoatrial node cells was used to cultivate. The expression on pacemaker-like cells markers of neurofilament protein （NF-160） and hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel （HCN） 4 were detected by immunofluorescence staining. The expression of pacing genes （NF-160， HCN4 and HCN2） were detected by qRT-PCR. Results Differentiated cells of bone marrow CD45-cells after induced by culture in vitro expressed NF-160 and HCN4. qRT-PCR analysis showed， compared with cultured sinoatrial node cells in vitro， the expression of NF-160 and HCN4 were higher， while expression of HCN2 was lower. Conclusion The sinoatrial node pacemaker-like cells can be induced and differentiated from mouse bone marrow CD45-cells， and the cells will be one choice of ideal seeding cells for biological pacemaker building.

[Key words] Pacemaker-like cells； CD45； HCN4； NF-160； Sinoatrial node

心律失常是常見病，嚴重將危及患者生命。目前，對于嚴重心律失常、病態竇房結綜合征患者，安裝心臟起搏器是理想的治療方法[1-3]。隨著生物學及干細胞研究的發展，利用其相關技術逐步構建生物起搏器，對受損心傳導系統的組織進行修復或替代，尤其是竇房結功能重建，可以使心臟的起搏和傳導功能得以修復[4-5]。構建生物起搏器的種子細胞目前以干細胞為主[6-7]。由于骨髓源干細胞具有多向分化潛能，可自體獲得，并能夠在體外擴增，是比較理想的種子細胞，所以本研究采用5-氮胞苷聯合竇房結細胞培養上清液體外誘導培養骨髓CD45-細胞，探討其分化為起搏樣細胞的可能性。研究周期為2014年8月～2015年1月，旨在為臨床因竇房結起搏細胞數量減少或功能衰退造成的心傳導系統功能障礙、嚴重心律失常等疾病的替代治療以及生物起搏技術的應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器和試劑

1.1.1 實驗動物 選取昆明小鼠10只，雌雄不限，4～5周齡，體重20～30 g，常規飼養，健康。

1.1.2 主要儀器和試劑 低糖DMEM和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Hyclone；DMEM-F12購自Gibco；5-氮胞苷（5-azacytidine）購自Sigma；兔源HCN4一抗、小鼠來源NF-160一抗和TRITC標記山羊抗兔IgG購自Abcam；FITC標記山羊抗小鼠IgG和DAPI購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA extraction kit購自Qiagen；PCR引物購自生工生物工程（上海）有限公司；SYBR Green Real Time-PCR Master Mix購自Invitrogen。免疫磁珠分選系統（Miltenyi Biotec），激光共聚焦顯微鏡（Nikon EZ-C1），PCR儀（Roche Light Cycler？誖480）。

1.2 小鼠骨髓CD45-細胞純化、擴增

隨機取5只小鼠經2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超凈臺無菌條件下取出小鼠股骨和脛骨數根，用低糖DMEM反復沖洗髓腔，收集沖洗液，經400目尼龍篩網過濾，1000 r/min離心6 min，棄上清。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培養基重新混懸細胞，37℃，5%CO2，飽和濕度培養，1 d后換液，棄去未貼壁細胞，以后每2天換液1次。細胞長至80%融合時，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清，10%FBS的低糖DMEM培養基重新混懸，以1∶3傳代。培養大約1個月后，采用免疫磁珠分選系統，選取CD45抗體，按照說明書操作，使細胞通過分選柱，收集CD45-細胞。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培養基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養。

1.3 小鼠竇房結組織分離、培養，收集培養基上清液

余下5只小鼠經2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超凈臺無菌條件下取出心臟，解剖顯微鏡下將心臟界嵴中部靜脈竇側、前腔靜脈根部0.3 cm × 0.3 cm × 0.3 cm大小組織塊，剪成1 mm左右大小的碎塊，添加0.07%胰蛋白酶消化，經篩網過濾后，1000 r/min離心5 min，加入添加了20%FBS的DMEM-F12培養基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養4 h，吸出未貼壁細胞重置于6孔板中，繼續培養。每天半量換液。

1.4 條件培養基誘導分化骨髓CD45-細胞

收集竇房結細胞培養后的培養液，經1000 r/min離心10 min，取上清與10%FBS的低糖DMEM培養基1∶1混合，并添加10 mmol/L的5-氮胞苷，作為CD45-細胞的條件培養基。CD45-細胞經條件培養基培養后2～3周，選取生長穩定細胞，進行檢測。

1.5 免疫熒光檢測分化細胞起搏標志物表達

將生長良好的分化細胞接種至8孔Chamber中，培養過夜，常規免疫熒光染色，一抗兔HCN4（1∶200）、小鼠NF-160（1∶300），二抗TRITC標記山羊抗兔IgG（1∶500），FITC標記山羊抗小鼠（1∶500）。激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.6 qRT-PCR檢測誘導分化細胞起搏基因表達

選擇生長良好的分化起搏樣細胞和小鼠竇房結細胞作為對照，采用RNA extraction kit提取兩種細胞的總RNA，稀釋濃度為200 ng/μL，然后逆轉錄合成cDNA，再采用SYBR Green Real Time-PCR Master Mix方法檢測小鼠NF-160、HCN4和HCN2基因表達，選取GAPDH作為內參，引物序列見表1。NF-160、HCN4和HCN2基因表達結果以倍數變化表示。設立對照以確定無DNA污染。反應體系為20 μL，其中cDNA模板1 μL，Nuclease-free water 8.2 μL，NF-160、HCN4、HCN2基因引物序列上游引物和下游引物各0.4 μL，2X SYBR Green Master Mix 10 μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min，進行35個循環（94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s），然后72℃再延伸10 min，4℃保存。實驗重復3次。

表1 SBYR Green法qRT-PCR引物

2 結果

2.1 小鼠骨髓CD45-細胞及誘導培養基誘導分化細胞

CD45-細胞貼壁后多為短梭形、三角形、多邊形，排列無規律，細胞體積較小，分散生長（圖1A）。生長良好的CD45-細胞更換為條件培養基后，細胞形態發生明顯變化，體積變大，大小比較一致，多呈長梭形，向同一方向生長（圖1B）。

2.2 分化細胞起搏標志物表達

經免疫熒光染色后，發現絕大多數分化細胞NF-160和起搏離子通道HCN4表達陽性，可見胞質內呈絲狀表達的NF-160和HCN4，胞核未著色（圖2，見封三）。

2.3 誘導分化起搏樣細胞起搏基因qRT-PCR檢測

與培養的竇房結細胞比較，分化起搏樣細胞NF-160、HCN4、HCN2基因表達水平不同，以倍數形式表示，其中NF-160、HCN4表達水平較培養的竇房結細胞高（P < 0.01），而HCN2表達水平低于培養的竇房結細胞（P < 0.01）。見表2和圖3。

表2 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達水平

注：與小鼠竇房結細胞比較，*P < 0.01

與小鼠竇房結細胞比較，*P < 0.01；誤差線表示實驗結果為3次實驗平均值

圖3 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達水平

3 討論

20世紀末，Makino等[8]首次以5-氮胞苷誘導培養骨髓間充質干細胞，發現能夠體外分化為心肌樣細胞，部分細胞的動作電位與心臟起搏細胞相似。隨后，大量研究圍繞起搏樣細胞的誘導分化展開。目前，常用方法有應用5-氮胞苷誘導分化方法[8-9]、起搏離子通道基因轉移方法[10-11]和竇房結細胞裂解液誘導分化方法[12]。但是這些體外誘導分化條件仍不完善，單獨應用成功率低，所以本實驗聯合應用5-氮胞苷和竇房結細胞培養上清液，提高誘導效率。

5-氮胞苷誘導分化機制是可引起細胞DNA中某些胞嘧啶的去甲基化，激活表達肌細胞的特異性啟動或分化調控基因，從而使啟動細胞向心肌分化，并表達心肌細胞特異性標志物，并有一部分細胞具有自律性[8，13]。由于竇房結是一個多態性的結構，心臟成纖維細胞能通過縫隙連接提高心肌細胞間的交通，因而穩定培養心肌的自發性收縮節律。因此，體外培養時不必將竇房結細胞完全分離純化。竇房結細胞培養液對CD45-細胞的誘導分化作用依賴于竇房結細胞分泌的細胞因子，可以為干細胞向起搏樣細胞分化提供一個接近于竇房結細胞生長的環境。

研究表明，竇房結起搏細胞的電生理特性為舒張期自動除極化，起主要作用的是起搏電流，其分子基礎是HCN，包括HCN1～HCN4，小鼠心臟主要表達HCN4和HCN2，以竇房結細胞HCN表達水平最高，所以選擇HCN4和HCN2作為檢測指標[14-17]。

本實驗采用全骨髓細胞直接接種，然后經免疫磁珠分選其中的CD45-細胞，換用條件培養基誘導分化的方法，從成年小鼠骨髓源干細胞得到竇房結起搏樣細胞。該方法操作簡便，得到細胞量大，細胞成活率高，傳代后，細胞形態漸趨同一，排列趨同一個方向，光鏡下可見胞體呈梭形，胞質淡染，胞核明顯，位于胞體中央。筆者采用小鼠竇房結細胞培養基上清液，并添加5-氮胞苷作為條件培養基，得到的起搏樣細胞能夠表達起搏離子通道HCN4和神經絲蛋白NF-160，由qRT-PCR結果看出，分化細胞表達起搏離子通道，符合起搏細胞特點，說明得到的細胞大部分是起搏樣細胞。形態學和免疫組織化學染色研究顯示，得到的細胞具有較好的生物學活性，證明誘導分化方法有效，得到起搏樣細胞在體外能夠存活較長時間，并保持其生物學活性，為生物起搏器奠定實驗基礎。

目前仍有尚未解決的問題，比如得到的細胞并非全部是起搏樣細胞，還包含有其他細胞成分，這些混雜的細胞會對進一步研究帶來干擾，因此進一步完善誘導分化條件或增加分化后的篩選指標，利用流式細胞分離技術或免疫磁珠分選，對得到的細胞進行分離提純，以提高細胞純度。

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（收稿日期：2015-03-15 本文編輯：李亞聰）