高脂肪飲食對大鼠青春期啟動影響的實驗研究

矯金玲 陳 華 董逸翔 陶 敏

·論 著·

高脂肪飲食對大鼠青春期啟動影響的實驗研究

矯金玲1陳 華2董逸翔2陶 敏2

目的觀察高脂肪飲食對大鼠青春期啟動的影響。方法20只雌性SD大鼠按配對設計的分組原則，分為標準組、高脂組，各20只。實驗第1天起標準組大鼠喂養標準飼料，高脂組大鼠喂養高脂肪飼料。每天觀察大鼠陰道口開放情況，當高脂組大鼠全部出現陰道口開放，即于當日下午處死全部大鼠。觀察兩組大鼠陰道口開放時間（VO）及第一性周期時間（D1），計算子宮、卵巢指數，采用放射免疫法檢測血清黃體生成素（LH）的含量。結果與標準組比較，高脂組陰道口開放時間（VO）（33.2±1.87）天，第一動情間期時間（D1）（35.7±1.16）天，均較標準組的（36.4±0.96）天、（37.5±0.53）天明顯提前（P＜0.01），LH 含量高脂組（6.275±0.422）mIU/mL，標準組（4.979±0.587）mIU/mL，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論高脂肪飲食可促使大鼠青春期啟動提前。

大鼠；青春期啟動；高脂肪飲食；實驗研究

性早熟是青春期提前的一種典型征象，是一種生長發育異常，近年發病率明顯上升已成為最常見的小兒內分泌疾病之一[1]。研究[2]顯示，兒童性成熟年齡的提前主要是外界因素作用的結果，其中以營養等生活條件的改善最為重要。動物實驗[3]表明，青春期啟動受營養因素影響，體質量低、攝食減少的營養不良大鼠則青春期延遲。隨著生活水平的提高，中國居民膳食結構發生變遷，人們更趨向于消費動物性食物，脂肪供能比顯著升高[4]。膳食結構中脂肪供能比的增加與兒童性早熟發病率上升之間有無因果關系，目前尚缺乏可靠的臨床及實驗依據。本實驗通過增加大鼠飼料中脂肪的供能比，探討高脂肪飲食與大鼠青春期啟動之間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 21日齡清潔級雌性SD大鼠10窩，購買于上海西普爾-必凱實驗動有限公司，合格證號：2008001601312。飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心，飼養條件：溫度18～23℃，濕度60%～80%，每日光照14h。按照配對設計的分配原則，根據窩別及體質量，從中選取20只，分為高脂組10只，飼以高脂肪飼料，標準組10只，飼以標準飼料。各組大鼠自由攝食及飲水。

1.2 動物飼料 動物飼料由南通特洛非飼料科技有限公司提供，標準飼料為大鼠生長期純化型顆粒飼料，按照美國AIN93G配方標準配制。高脂飼料在標準飼料的基礎上調整脂肪供能比為45.0%而成[5]。標準飼料成分含量（以1000 g計）：酪蛋白200 g，玉米淀粉 397.48 g，糊精 132 g，蔗糖 100 g，豆油 70 g，纖維素 50 g，礦物質 35 g，維生素 10 g，L-胱氨酸 3 g，氯化膽堿 2.5 g，特丁基對苯二酚（TBHQ）0.014 g。高脂飼料成分含量（以1000 g計）：酪蛋白245.41 g，玉米淀粉 318.19 g，蔗糖 100 g，豆油 85.9 g，豬油 147.8g，纖維素 61.35 g，礦物質 33.45 g，維生素 0.32 g，L-胱氨酸 3.68 g，氯化膽堿 3.83 g，TBHQ 0.05 g。各組飼料主要營養素占總熱卡百分比見表1。

表1 各組飼料主要營養素供能比（%）

1.3 實驗方法 實驗第1天（大鼠21日齡）起至大鼠處死日（大鼠36日齡），每日記錄各組大鼠進食量，用電子秤測大鼠體質量，用直尺記錄大鼠尾長。每天9∶00觀察大鼠陰道口開放情況，對陰道口開放的大鼠，每日進行陰道細胞涂片觀察其性周期變化，待高脂組大鼠均出現陰道口開放，則于當日15∶00處死所有大鼠。實驗第16天（大鼠36日齡）大鼠禁食不禁水5h稱重后，水合氯醛麻醉下腹腔動脈取全血4～5mL，離心 3000r/min×10min，吸取上層血清，置于-20℃冰箱凍存備用。大鼠取血后，開腹，分離周圍結締組織，取出雙側卵巢及雙角子宮，子宮遠端至子宮頸，用電子天平稱重卵巢和子宮濕重。

1.4 檢測指標與方法 大鼠陰道口開放時間（VO）：待高脂組全部大鼠陰道口開放時（大鼠36日齡），將標準組陰道口未開放的大鼠陰道口開放時間記為37日）。大鼠第一性周期時間（D1）：各組大鼠陰道口開放后，每日9∶00做大鼠陰道脫落細胞涂片，可觀察到規則的性周期出現，順序為動情前期、動情期、動情后期和動情間期。實驗第16天（大鼠36日齡）處死所有大鼠時，將處死日前陰道口開放但未出現第一動情間期的D1記為37日，將處死日前仍未出現陰道口開放大鼠的D1記為38日。形態學指標測量：根據器官指數計算公式（器官指數=器官濕重/體質量）計算卵巢指數和子宮指數。血清促黃體生成素（LH）水平采用放射免疫法檢測，操作嚴格按照試劑盒（北京華埠力特生物科技研究所）說明書進行。

2 結 果

2.1 各組大鼠進食量、體質量比較 不同飼料組大鼠日均進食量比較，大鼠體質量、體質量增量比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 2。

表2 各組大鼠體質量增量、日均進食量的比較（g，±s）

表2 各組大鼠體質量增量、日均進食量的比較（g，±s）

組別標準組高脂組只數10 10體質量增量74.2±4.022 74.4±6.947日均進食量88.3±31.229 90.4±32.053

2.2 大鼠陰道口開放時間（VO） 高脂組全部大鼠陰道口開放時（大鼠36日齡），標準組大鼠仍有5只未見陰道口開放，與較標準組比較，高脂組大鼠陰道口開放時間提前，差異有統計學意義（P＜0.01），見表3。

2.3 大鼠第一性周期時間（D1） 各組各期的陰道細胞涂片表現相同，性周期的持續時間大致相同，約4～5天。實驗第16天（大鼠36日齡），高脂組有7只大鼠出現第一個動情間期，標準組無大鼠出現第一個動情間期。高脂組大鼠第一個性周期建立的時間較標準組大鼠顯著提前，差異有統計學意義（P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠VO、D1時間比較（d，±s）

表3 各組大鼠VO、D1時間比較（d，±s）

注：與標準組比較，**P＜0.01

組別標準組高脂組只數10 10 VO 36.4±0.96 33.2±1.87**D1 37.5±0.53 35.7±1.16**

2.4 臟器指數 高脂組大鼠子宮、卵巢指數較標準組高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 4。

表4 各組大鼠子宮、卵巢指數比較（±s）

表4 各組大鼠子宮、卵巢指數比較（±s）

注：與標準組比較，*P＜0.05

組別標準組高脂組只數10 10子宮指數（×10-3）0.975±0.072 1.183±0.134*卵巢指數（×10-4）4.428±0.784 5.806±0.951*

2.5 各組血清LH水平比較 高脂組大鼠血清LH為（6.275±0.422）mIU/mL，標準組為（4.979±0.587）mIU/mL，高脂組大鼠明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

人類生殖系統的發育和功能維持受下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）的控制。青春期啟動前HPGA功能處于靜止狀態，下丘腦脈沖發生器活動處于抑制狀態，從而使性腺處于幼年狀態。正常青春期啟動時，隨著下丘腦的成熟，下丘腦脈沖發生器活動增強，HPGA功能激活，下丘腦神經元表達促性腺激素釋放激素（GnRH）水平增加，GnRH脈沖式分泌水平上升、脈沖幅度大、出現晝夜節律，加之接受刺激的細胞膜表面受體增加，導致垂體LH和卵泡刺激素（FSH）脈沖式釋放的的頻率和數量增加，尤其是LH的增加。這種促性腺激素的脈沖式分泌增加了對性腺的刺激，從而引起性腺發育，出現性腺活動，發生卵巢排卵，黃體生成，子宮壁增厚，子宮內膜出現周期性改變以及出現第二性征和生長加速[6]。

大鼠HPGA的發育與人類有相近之處，且性周期短（4～5天），性發育指征明確，便于觀察，已成為有關性發育研究的主要實驗動物[7]。在大鼠青春前期，HPGA軸功能處于靜止期，使性腺處于幼年狀態，青春期啟動時，HPGA軸功能激活，GnRH神經元脈沖分泌頻率增加，此時GnRH神經元中GnRH mRNA表達水平增加，LH、FSH和性腺類固醇激素水平明顯上升[8]，出現陰道口開放，陰道脫落細胞呈周期性改變，規則的性周期出現是大鼠青春期啟動進入青春期的表現。同時卵巢和子宮增重、增大，卵巢發生排卵，黃體生成，子宮壁增厚。對大鼠青春期啟動的判斷，本實驗根據公認的標準，即以陰道口開放和第一次排卵的發生作為判斷雌性大鼠的標準。當HPGA功能激活時，LH水平明顯上升，卵巢、子宮增重，血清LH水平、卵巢指數和子宮指數可在一定程度上提示青春期的啟動[9]。

本實驗結果顯示，與標準組比較，高脂組大鼠陰道口開放時間及出現第一個動情間期時間明顯提前，大鼠陰道口開放后，陰道細胞涂片均觀察到規則的性周期，每個周期持續約4～5天，按動情前期、動情期、動情后期、動情間期的順序出現。與標準組比較，高脂組大鼠子宮、卵巢指數增高，血清LH水平增高，達青春早期水平。以上結果提示，高脂組大鼠較標準組正常發育的同齡、同窩、體質量相近的大鼠青春期啟動提前，而發育狀況與正常進入青春期的大鼠相似，可判定高脂組大鼠HPGA功能激活，大鼠青春期啟動提前，至于GnRH神經元中GnRH mRNA表達水平的確切數值，需進一步實驗驗證。

營養過剩致性早熟的機制，目前有“臨界體質量”學說，即營養過剩導致體質量增加，當體質量到達某一臨界時，出現青春期啟動[10]。本實驗對大鼠體質量的測量發現，實驗期間各組大鼠體質量及體質量增量無顯著差異。說明高脂組大鼠較標準組大鼠青春期啟動提前，與體質量相關性不大，提示高脂飲食引起大鼠青春期啟動提前，存在“臨界體質量”以外的機制。有學者認為營養對青春發育的調控是通過某些代謝信號因子將機體營養狀態的信息傳遞給大腦，各因子相互作用協同調控下丘腦分泌GnRH，影響HPGA，從而搭建起營養因素與性發育的關聯，動物實驗和分子生物學研究發現，除了瘦素是影響青春期啟動的允許因子[11]，與能量代謝有關的因子如生長激素釋放肽、生長激素釋放肽、胰島素樣生長因子和神經肽等均可以作用于生殖軸影響青春期的啟動[12]。高脂肪飲食對HPGA的影響是否通過代謝信號實現，以及通過哪些代謝信號，有待進一步研究。

［1］性早熟診療指南（試行）【衛辦醫政發（195）號】［J］.中國兒童保健雜志，2011，19（4）：390-392.

［2］孫艷艷，俞建.性早熟病因的研究進展［J］.實用兒科臨床雜志，2011，26（20）：1599-1601.

［3］申甜，李嬪，許麗雅.哺乳期營養對雌鼠陰門開啟時間及卵巢功能的影響［J］.臨床兒科雜志，2008，26（12）：1041-1044.

［4］翟鳳英，何宇娜，王志宏，等.中國城鄉居民膳食營養素攝入狀況及變化趨勢［J］.營養學報，2005，27（3）：181-184.

［5］楊愛君，崔雁，葉卉初，等.營養性肥胖動物模型的建立［J］.臨床和實驗醫學雜志，2005，4（3）：156.

［6］杜敏聯.性早熟的臨床研究進展——兒科疾病（2）［J］.新醫學，2007，38（2）：118-119.

［7］戚穎，楊紅舟，張永煜.兒童性早熟臨床治療與動物實驗研究進展（上）［J］.中國藥師，2009，12（7）：876-877.

［8］戴方偉，陳文文，毛棟森，等.SD雌性大鼠性發育早期性器官等臟器和性激素的動態變化［J］.中國比較醫學雜志，2009，19（7）：34-37.

［9］伍傳金.雌性大鼠青春期起始的內分泌調控機制綜述［J］.中國食品衛生雜志，1994，6（2）：51-52.

［10］朱逞.肥胖與青春期發育［J］.中國實用兒科雜志，2006，21（7）：503-504.

［11］李穎，孫長顥.瘦素在人類青春期的作用［J］.衛生研究，2004，33（1）：121-123.

［12］蔡德培.兒童性早熟的研究進展［J］.實用兒科臨床雜志，2005，26（6）：497-499.

（收稿：2014-04-20 修回：2014-08-20）

Effect of High Fat Diet on the Onset of Puberty of Rats

JIAO Jinling1，CHEN Hua2，DONG Yixiang2，TAOMin2.1 Department of Pediatrics，TCM Hospital of Xiaoshan District，Hangzhou，Hangzhou(311201)，China;2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou（310053）,China

Objective To investigate the effect of high fat diet on the onset of puberty of rats.MethodsTwenty female SD rats were randomized into standard group and high-fat group by paired design,10 for each group.From the first day of the experiment,rats in standard group were fed with standard diet,rats in high-fat group were fed with high fat diet.When all 10 rats in high-fat group had vaginal opening（VO）,then they were sacrificed on the afternoon of that day.The times of VO and first cycle（D1） were observed,the uterus index and ovarian index were calculated,and the content of serum luteinizing hormone（LH）was detected by radioimmunoassay.ResultsCompared with standard group,VO and D1 was significantly earlier in high-fat group（VO：33.2±1.87d vs 36.4±0.96d；D1：35.7±1.16d vs 37.5±0.53d；all P＜0.01），and the serum LH were statistically increased in high-fat group（6.275±0.422mIU/mL vs 4.979±0.587mIU/mL，P＜0.05）.ConclusionThe high fat diet can induce early puberty starts in rats.

rats；puberty starts；high fat diet；experimental study

p

浙江省教育廳高校科研計劃（No.20060743）；浙江省醫藥衛生科技計劃（No.2005A073）

1杭州市蕭山區中醫院兒科（杭州 311201）；2浙江中醫藥大學（杭州 310053）

陳華，Tel：18958022829