茶多酚對卵巢癌SKOV3細胞自噬水平的影響及相關機制研究

詹 欣 張玲云 王志華

茶多酚對卵巢癌SKOV3細胞自噬水平的影響及相關機制研究

詹 欣 張玲云 王志華

目的研究茶多酚（EGCG）對人卵巢癌SKOV3細胞自噬水平的影響及相關機制。方法用EGCG處理SKOV3細胞，Western blot檢測自噬相關蛋白LC3-II及蛋白激酶B（PKB）信號通路相應蛋白表達變化。結果EGCG處理SKOV3細胞后，自噬相關蛋白LC3-II表達上調，并呈一定的時間濃度依賴性。EGCG處理SKOV3細胞后，AKT的磷酸化水平下調，AKT激活劑胰島素樣生長因子1（IGF-1）預處理后，自噬相關蛋白LC3-II高表達被抑制。結論EGCG通過AKT介導的信號通路誘導SKOV3細胞自噬水平升高。

卵巢癌；SKOV3細胞；茶多酚；PKB；自噬

茶多酚是從茶葉中提取的主要活性成分之一，目前研究表明其具有多種藥理作用[1]。自噬（autophagy）是細胞在應激狀態下通過降解損傷細胞器或代謝產物促進細胞存活的防御機制[2]，自噬水平升高時，胞漿型微管相關蛋白1的輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3），即 LC3-I，會轉變為膜型LC3，即LC3-II，故本研究以自噬相關蛋白LC3-II作為評估自噬水平高低的標準。自噬在腫瘤的發生發展及治療過程中起著非常重要的作用[3]。研究[4]表明，茶多酚能夠誘導卵巢癌細胞凋亡率增加。本研究觀察茶多酚對卵巢癌SKOV3細胞自噬水平的影響及其相關信號通路，為臨床卵巢癌治療提供新的思路及靶點。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 人卵巢癌SKOV3細胞購自上海中科院細胞研究所；抗LC3-B多克隆抗體購自Novus公司；蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）多克隆抗體、磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，p-AKT）多克隆抗體均購自Cell Signaling公司；抗GAPDH單克隆抗體購自Santa Cruz公司；IMDM培養基、胰蛋白酶購自美國HyClone公司；胰島素樣生長因子（IGF-1）購自R&D公司；胎牛血清購自四季青公司；3-MA購于Sigma公司。

1.2方 法

1.2.1 人卵巢癌SKOV3細胞培養 人卵巢癌SKOV3細胞用含10%胎牛血清的IMDM培養基，在37℃，5%CO2的培養箱中常規培養。0.25%胰酶（含EDTA）消化傳代。培養24h后進行實驗處理。

1.2.2 Western blot檢測蛋白量變化 Western blot檢測蛋白LC3、p-AKT、AKT的變化。收集SKOV3細胞后，用RIPA裂解液冰上裂解30min，13 000g離心10min，吸取上清，BCA法蛋白定量。與5×樣品緩沖液混合后，煮沸 6min。取樣品（40μg）進行 SDS-聚丙烯凝膠電泳，然后轉印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1h，相應的一抗4℃孵育過夜，TBS-T洗10min×3次，加入含辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1h，ECL法顯色曝光，圖像采用LAS-4000-mini化學發光成像系統進行灰度值分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EGCG誘導SKOV3細胞自噬 用不同濃度（0、10、20μg/mL）EGCG 處理 SKOV3 細胞 2h，0μg/mL 組作為對照組，可以觀察到自噬相關蛋白LC3-II的表達量增加，并呈一定濃度依賴性（n=3，P＜0.05，見圖1A）。在不同時點（0、1、2、6h）20μg/mL EGCG 處理SKOV3細胞，以0h為對照組，隨著時間變化，自噬相關蛋白LC3-II的表達量先升高后下降，峰值出現在1～2h（n=3，P＜0.05，見圖 1B）。以上結果表明 EGCG能誘導SKOV3細胞自噬水平升高，并呈一定的濃度和時間依賴性。

圖1A EGCG誘導SKOV3細胞自噬相關蛋白LC3-II表達量與濃度的關系

圖1B EGCG誘導SKOV3細胞自噬相關蛋白LC3-II表達量與時間的關系

2.2 AKT信號通路在EGCG誘導SKOV3細胞自噬過程中的作用 EGCG刺激SKOV3細胞之后，p-AKT和的表達水平隨著作用時間的延長而下降，并在30或 60min時達最低值（n=3，P＜0.05，見圖 2A，以0min為對照組）。表明在SKOV3細胞中，EGCG可以抑制AKT信號通路。為進一步明確AKT信號通路在EGCG誘導的內皮細胞自噬中的作用，用AKT激活劑 IGF-1（insulin-like growth factor 1，200ng/mL）激活AKT信號通路，以未處理為對照組，IGF-1對SKOV3細胞LC3-Ⅱ的表達無影響（n=3，P＞0.05，見圖2B），EGCG處理組LC3-II的表達明顯增加（n=3，P＜0.05，見圖2B），IGF-1提前2h預處理組能顯著抑制EGCG誘導的SKOV3細胞自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的表達（n=3，P＜0.05，見圖 2B），表明 AKT 信號通路在 EGCG 誘導SKOV3細胞自噬的過程中起著重要作用。

圖2A EGCG抑制AKT信號通路與時間的關系

圖2B AKT信號通路在EGCG誘導SKOV3細胞自噬中的作用

3 討 論

茶多酚是從茶葉中提取的重要活性成分之一，研究[5]表明，其具有抗腫瘤作用，能夠促進腫瘤細胞凋亡，抑制其增殖和遷移。付春紅等[4]研究表明，茶多酚對SKOV3細胞的生長有明顯抑制作用并能夠誘導SKOV3細胞凋亡，推測活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的增高可能是導致卵巢癌SKOV3細胞凋亡的原因。

自噬是廣泛存在的一種生命現象，細胞在應激狀態下形成自噬體膜，包裹損傷細胞器或代謝產物，并與溶酶體結合成自噬溶酶體，最后降解包裹內容物，以維持細胞本身代謝需要及細胞器的更新，對細胞在不利環境下的存活有重要意義[6]。有多條信號通路參與了對自噬的調節，各條信號通路之間又相互交聯，極其復雜[7]。目前研究較多的為mTOR（mammalian target of rapamycin）信號通路[8]。一般情況下mTOR處于活化狀態，磷酸化抑制自噬的發生。但是在細胞氧化應激、缺血缺氧、炎癥刺激等應激狀態下，AMP/ATP（一磷酸腺苷/三磷酸腺苷）比值增加，增強 AMPK（Adenosine 5‘-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMP依賴的蛋白激酶）活性，從而抑制mTOR的磷酸化水平，促進細胞自噬。

自噬與凋亡之間關系密切，其上游多條信號通路基本相同[9]。多種抗腫瘤藥物在誘導腫瘤細胞凋亡的同時誘導了腫瘤細胞的自噬，但自噬在腫瘤細胞凋亡中的作用一直存在爭議，部分學者認為過度的自噬導致腫瘤細胞發生了自噬性死亡，并稱為II型程序性細胞死亡[10]，但部分學者認為自噬僅為腫瘤細胞凋亡過程中的伴隨現象，而非自噬介導的死亡[11]。Satoh等[12]報道茶多酚能夠誘導人間皮瘤細胞凋亡及自噬水平均升高，但抑制自噬能明顯增加茶多酚誘導的人間皮瘤細胞凋亡率，說明自噬在茶多酚誘導間皮瘤細胞凋亡過程中起應激性保護作用。本研究結果表明，茶多酚能夠誘導人卵巢癌SKOV3細胞自噬水平升高，并呈一定的時間濃度依賴性，隨著茶多酚濃度增加，SKOV3細胞自噬水平逐漸升高，以一定濃度EGCG刺激SKOV3細胞，其自噬水平先升高，后下降，在1～2h達到頂峰。EGCG刺激之后，p-PKB的表達水平隨著作用時間的延長而下降，說明EGCG抑制了PKB信號通路的表達，但使用PKB激活劑IGF-1激活PKB信號通路后，明顯抑制了EGCG誘導的SKOV3細胞自噬水平，這表明PKB信號通路在EGCG誘導SKOV3細胞自噬的過程中起著重要作用。但EGCG誘導的SKOV3細胞自噬在EGCG誘導的SKOV3細胞凋亡中所起的作用尚不明確，有待進一步研究。

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［6］Eskelinen EL，Saftig P.Autophagy∶A lysosomal degradation pathway with a central role in health and disease［J］.Bba-Mol Cell Res，2009，1793（4）：664-673.

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［12］ Satoh M，Takemura Y，Hamada H，et al.EGCG induces human mesothelioma cell death by inducing reactive oxygen species and autophagy［J］.Cancer cell international，2013，13（1）：19.

（收稿：2014-04-12 修回：2014-08-04）

Effect of EGCG-induced Autophagy on Human Ovarian Cancer Cell Line SKOV3 and the UnderlyingMechanism

ZHAN Xin,ZHANG Lingyun,WANG Zhihua.Department of Obstetrics&Gynecology,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of EGCG-induced autophagy on human ovarian cancer cell line SKOV3 and to explore the mechanism.MethodsHuman ovarian cancer cell SKOV3 were treated with EGCG,then autophage-associated protein LC3-II and AKT protein expression on the cells was detected by Western blot.ResultsAfter EGCG treatment,the level of LC3-II was up-regulated in a dose dependent manner,while the level of phospho-AKT was decreased.Pretreatment with AKT activator insulin-like growth factor 1,the EGCG-induced LC3-II expression was suppressed.ConclusionEGCG can induce autophagy in huaman ovarian cancer cell SKOV3 through AKT signaling pathway.

ovarian cancer；SKOV3 cells；epigallocatechin-3-gallate；PKB；autophagy

杭州市第一人民醫院婦產科（杭州 310006）

王志華，Tel：15868189500