體外誘導體細胞逆分化為多能干細胞及對老年猴的影響

朱向情，蔡學敏，王強，沈麗蓉，朱光旭，龐榮清，潘興華

體外誘導體細胞逆分化為多能干細胞及對老年猴的影響

朱向情，蔡學敏，王強，沈麗蓉，朱光旭，龐榮清，潘興華

目的探討誘導自體外周血單個核細胞逆向分化為多能干細胞樣細胞的方法及誘導細胞對老年獼猴衰老相關血液生化指標的影響。方法利用魚卵母細胞提取物與體外共培養法誘導獼猴外周血單個核細胞轉化為多能干細胞樣細胞，采用靜脈回輸的方法，將該細胞回輸給20～24周歲的老年獼猴，檢測并比較回輸前后獼猴的體重、血常規以及超氧化物歧化酶（SOD）等指標的變化。結果與自體誘導性多潛能干細胞回輸前相比，回輸后3個月，獼猴體重無明顯變化，外周血中SOD的活力和血小板的數量顯著升高，血Na+、K+、CO2、AG含量顯著升高，肌酐、尿酸、LDL-膽固醇含量顯著降低。結論魚卵細胞提取物可誘導部分外周血單個核細胞逆向分化為多能干細胞樣細胞，該細胞能夠顯著改善與衰老相關的血液生化指標。

獼猴；誘導性多潛能干細胞；生化指標；成體細胞；抗衰老

誘導體細胞重編程為多能干細胞是近年來生命科學研究領域的重大技術突破。自2006年以來，科學家利用轉Oct4、Kif4、Sox2、c-Myc基因法，成功將人和鼠的成纖維細胞重編程為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）[1-2]。還有人利用蛋白轉染和化學物質、microRNAs誘導等方法誘導血細胞、黑色素細胞、角質形成細胞、胰腺β細胞、神經干細胞、脂肪干細胞等成體細胞重編程為iPSC[3-4]。上述方法獲得的iPSC均具有類似胚胎干細胞的強大分化潛能，可能成為干細胞治療技術發展的新來源，但目前尚存在諸多技術問題。2010年，本課題組利用魚卵母細胞提取物成功誘導人和鼠的體細胞重編程為多能干細胞樣細胞，該細胞表達iPSC的部分標志性抗原，體內外誘導分化實驗證實具有分化為神經、肌肉、血管、骨等多種成熟細胞的能力，初步命名為誘導性多潛能干細胞（induced multipotent stem cell,iMSC）[5-6]。為證實該iMSC的生物學功能，本研究利用魚卵細胞提取物誘導外周血單個核細胞逆向分化為iMSC，并探討了iMSC對老年獼猴衰老相關血液生化指標的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設備DMEM/F12培養基（美國Hyclone公司），新生牛血清（美國Gibco公司），雙抗（美國Hyclone公司），檸檬酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司），Nacl（上海凌峰化學試劑有限公司），超氧化物歧化酶測試盒（南京建成），淋巴細胞分離液（南京建成），百萬級層流超凈工作臺（SW-CL-2F型，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司），百級層流超凈工作臺（吳江市綠鳥凈化設備廠），倒置相差顯微鏡（BX60型，日本奧林巴斯），LEICA RM2135組織切片機（德國萊卡）。

1.2 實驗動物及處理選擇年齡為20~24周歲、體重為5~8 kg的健康獼猴10只（雌猴和雄猴各5只），由中國醫學科學院昆明醫學生物學研究所實驗動物中心提供，所有獼猴均按照正常條件飼喂和飲水。

1.3 魚卵細胞提取物的制備選擇卵母細胞卵黃充滿時相的昆明當地產鯽魚，用75%的酒精浸泡15~20 min，在無菌條件下，取出魚卵，用研缽將其磨碎，按體積約1∶1的比例加入生理鹽水，1000 r/min離心10 min，然后3000 r/min離心10 min，取上清，過濾除菌。采用考馬斯亮藍法（Bradford法）測定蛋白含量，用DMEM/F12培養基稀釋成10mg/ml，4℃保存備用。

1.4 外周血單個核細胞分離及誘導處理無菌條件下抽取實驗猴外周血20 ml，加入等量的Hank液后混勻，小心加入到淋巴細胞分離液之液面上，以2500 r/min離心15 min，收集淋巴細胞層；放入含Hank液試管中，充分混勻后，以1500 r/min離心10 min。吸棄上清液，沉淀經反復洗2次，即得所需細胞。

將分離到的單個核細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基調整細胞濃度為約（2~5）×105個/ml，接種于含有DMEM/F12培養基的75 cm2的培養瓶中，添加魚卵細胞提取物至終濃度為0.24mg/ml。將細胞置于37℃、5%CO2、90%濕度條件下培養，培養48 h更換培養液及誘導劑，繼續培養72 h后離心收集細胞。

1.5 誘導細胞回輸將誘導處理72 h并鑒定后的細胞調整細胞濃度為5×106個/ml，并按照5×106個細胞/kg靜脈回輸給實驗猴。每月回輸1次，共回輸3次。

1.6 流式細胞術分析細胞表型收集不同誘導時間點（0、24、48、72 h）的細胞，置于流式分析管中，加入4ml PBS，1800 r/min離心5min，棄上清，然后加入4 ml PBS，重復上述操作3次進行細胞清洗。調節細胞濃度為約1×106個/100μl，每個分析管中分別加入標記抗體（OCT4、CD3、CD34、SSEA4、Nanog、C-myc），輕輕吹打混勻，4℃避光孵育30 min，然后加4 ml PBS，1800 r/min離心5 min，棄上清，重復3次，加500μl PBS，輕輕吹打混勻后，按流式細胞分析要求進行分析檢測。

1.7 超氧化物歧化酶（SOD）的活力測定細胞回輸前和每次細胞回輸后1個月，采集老年獼猴外周血，采用超氧化物歧化酶測試盒檢測SOD活力，操作方法見表1。

表1 超氧化物歧化酶活力測定方法

1.8 血液生化指標檢測于實驗前和細胞回輸3次后，分別采集實驗猴外周血，送本院檢驗科分別檢測血小板數量及Na+、K+、CO2、AG、肌酐、尿酸、LDL-膽固醇含量，取3次結果的平均值。

2 結果

2.1 魚卵提取物蛋白含量根據蛋白含量標準曲線繪制方法，以標準蛋白OD值為縱坐標，標準蛋白濃度為橫坐標做標準曲線，求得直線回歸方程為：y=0.7286x+0.0001，R2=0.9998。魚卵母細胞提取物總蛋白含量利用該蛋白標準曲線進行測定，總蛋白含量為40mg/ml。將魚卵母細胞提取物稀釋成總蛋白含量為10mg/ml的溶液，4℃保存備用。

2.2 誘導后的細胞表型魚卵細胞提取物誘導處理外周血單個核細胞至0、24、48、72 h時，經流式細胞分析，表達CD34、CD3、OCT4、SSEA-4、Nanog、C-myc的細胞比例隨誘導時間的增加而增加（圖1）。

圖1 誘導性多潛能干細胞相關抗原表達比例

2.3 體重變化誘導性多潛能干細胞回輸前及3次回輸后1個月，實驗猴體重分別為(6.170±0.956)kg、(6.390±0.936)kg、(6.490±1.124)kg、(6.590±0.860)kg，體重雖呈增加趨勢，但是差異尚無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 超氧化物歧化酶活力與回輸前相比較,誘導性多潛能干細胞回輸1、2、3次后，實驗猴血清中的SOD活力均顯著升高（P＜0.05），分別為72.59± 30.39、115.07±5.63、114.15±10.10、106.42±10.95，但多次回輸誘導細胞與回輸1次之間無明顯差異（P＞0.05）。

2.5 外周血血小板數量變化誘導性多潛能干細胞回輸3次后，外周血中的血小板數量、血小板壓積、平均血小板體積均顯著高于回輸前（P＜0.05，表2）。

表2 細胞回輸前后血小板的變化

2.6 外周血回輸前后生化指標的變化誘導細胞回輸3次后，血液中Na+、K+、CO2和陰離子間隙等指標與回輸前均顯著升高，而肌酐、尿酸和LDL-膽固醇均顯著降低。見表3。

表3 細胞回輸前后生物化學指標的變化

3 討論

衰老是人生命過程中一種無法回避的自然現象，延緩或逆轉衰老是醫學研究的重大課題和美好愿望，但迄今為止，尚未找到理想方法。研究發現，年輕鼠的血液或干細胞可使老年鼠變年輕，包括改善神經、肌肉、腎功能和減少骨組織的鈣流失等[7-9]。2010年，本研究課題組利用卵母細胞提取物誘導人和鼠成體成纖維細胞重編程為具有多潛能分化能力的細胞——iMSC，該細胞在制備過程中不涉及轉基因技術和人工合成的化學小分子物質，不改變重編程細胞的基因組成和結構，也減少了化學物質對基因組的損傷。本研究旨在探討是否可利用卵細胞提取物誘導獼猴外周血單個核細胞重編程為iMSC，以及該細胞是否具有改善老年獼猴衰老狀態的作用。

SOD是一種生命活性物質，能夠有效清除新陳代謝過程中自由基的產生，防止自由基對機體的損傷，延緩機體衰老[10]。本研究結果顯示，誘導細胞回輸后，SOD的活性與回輸前相比顯著升高，表明獼猴體對自由基的清除能力提升，但多次回輸誘導細胞后SOD活力并沒有顯著提高，其機制有待進一步研究。

有研究報道，老年人血小板數量減少，血小板的黏附和凝集能力升高，凝血功能亢進，促進血栓的形成。本研究結果顯示，誘導性多潛能干細胞回輸后與回輸前相比，獼猴血小板數量、血小板壓積、平均血小板體積均顯著升高，提示誘導性多潛能干細胞的回輸具有預防血栓形成的作用。

腎臟是人體最重要的代謝器官之一。研究表明[11]，衰老腎臟的保鈉能力降低，代謝和排泄廢物的能力下降，引起機體鈉水平降低和肌酐、尿酸等含量升高。本研究結果顯示，回輸誘導細胞3次后，血液中的鉀離子和鈉離子水平均呈不同程度的升高，血中肌酐和尿酸水平均顯著下降，提示該誘導細胞可改善衰老獼猴的腎功。

LDL-膽固醇含量是評估罹患心血管疾病風險的一個重要指標，過高的LDL-膽固醇容易沉積在血管壁上，形成粥樣硬化，造成血管壁傷害。本研究結果顯示，自然衰老獼猴3次回輸誘導細胞后，LDL-膽固醇含量顯著降低，表明可能對動脈粥樣硬化起到一定的預防作用。

綜上所述，本研究通過比較分析自體來源的誘導性多能干細胞回輸前后獼猴的血液生化指標，提示該細胞具有一定的延緩衰老或改善老年性功能退變的作用。這僅是初步的觀察結果，詳細作用及機制還需要深入研究。

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[3]Okita K,Hong H,Takahashi K,et al.Generation of mouse induced pluripotent stem cells with plasmid vectors[J].Nat Protoc,2010,5(3):418-428.

[4]Loh YH,Agarwal S,Park IH,et al.Generation of induced pluripotent stem cells from human blood[J].Blood,2009,113(22): 5476-5479.

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[11]Cynthia J Kenyon.The genetics of ageing[J].Nature,2010,464: 504-512.

Induction of body cell retrodifferentiation intomultipotential stem cell in vitro and its effects on senilemonkey

Zhu Xiangqing,Cai Xuemin,Wang Qiang,Shen Lirong,Zhu Guangxu,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To discuss the method for the induction of peripheral blood mononuclear cell retrodifferentiation into multipotential stem cell in vitro and the effects of inducer cell on senile rhesus monkeys'senescence-related blood biochemical indicators.Methods Themonkeys'peripheral bloodmononuclear cellswere induced to transform intomultipotential stem cells by the co-culturewith fish oocyte extract in vitro.Those cellswere intravenously re-infused to senile rhesusmonkeyswith the age of 20 to 24 years old.The weight,blood routine,and superoxide dismutase(SOD)were detected and compared before and after the reinfusion. Results Threemonths after the reinfusion,compared with themonkeys receiving the reinfusion of self-induced multipotential stem cells,those taking the reinfusion ofmultipotential stem cells induced in vitro had no significant changes in weight,but their vigor of SOD and platelet number in peripheral blood significantly increased.The content of blood Na+,K+,CO2,and AG significantly increased.However,the content of creatinine,uric acid,and LDL-cholesterol significantly decreased.Conclusion Fish oocyte extract can induce the retrodifferentiation of partial peripheral blood mononuclear cells intomultipotential stem cells which can significantly improve senescence-related blood biochemical indicators.

rhesusmonkey;inducedmultipotential stem cell;biochemical indicator;adult cell;anti-aging

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0816-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.002

2015-04-17）

國家科技支撐計劃（2014BI01B0）；云南省戰略性新興產業專項（2013DA004）

650032昆明，成都軍區昆明總醫院細胞生物治療中心,干細胞與免疫細胞生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室,云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室,云南省干細胞工程實驗室

龐榮清,E-mail：pangrq2000@aliyun.com；潘興華,E-mail：xinghuapang@aliyun.com