河南番茄褪綠病毒的分子鑒定

胡京昂 萬(wàn)秀娟 李自娟 黃 文 李武高 應(yīng)芳卿

（鄭州市蔬菜研究所，河南鄭州 450015）

近幾年來(lái)，由煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播的多種病毒病對(duì)國(guó)內(nèi)番茄生產(chǎn)造成了巨大的損失，尤以番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）、番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）和番茄侵染性褪綠病毒（Tomato infectious chlorosis virus，TICV）最為突出（張穗 等，2006；胡京昂 等，2010；胡京昂 等，2013）。

1998年，美國(guó)佛羅里達(dá)州首次發(fā)現(xiàn)了番茄褪綠病毒（Wisler et al．，1998），之后意大利、巴西、以色列等國(guó)也相繼進(jìn)行了報(bào)道（Accotto et al．，2001；Segev et al．，2004；Freitaset al．，2012）。該病毒屬長(zhǎng)線(xiàn)形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），在自然條件下通過(guò)粉虱傳播，可以侵染茄科、番杏科、莧科、夾竹桃科、藜科、菊科和藍(lán)雪科等植物，不能通過(guò)摩擦接種傳播（Wintermantel & Wisler，2006）。

我國(guó)最早于2013年發(fā)現(xiàn)番茄褪綠病毒，該病毒會(huì)引起番茄葉片褪綠和黃化，尤以植株下部葉片葉脈濃綠，葉脈間褪綠、黃化最為明顯，貌似缺素癥（Zhao et al．，2013）。2014 年 8 月，筆者在河南省鄭州、濟(jì)源、新鄭、中牟、扶溝等地的番茄田間發(fā)現(xiàn)了大量疑似感染ToCV的番茄植株。本文以田間疑似感染ToCV的番茄葉片為樣品，提取植物總RNA，經(jīng)RT-PCR、PCR檢測(cè)和序列對(duì)比分析，以期明確其病原，為進(jìn)一步防治該病害奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病毒樣本 2014年8月在河南省鄭州、中牟、新鄭、濟(jì)源和扶溝等5個(gè)地區(qū)的番茄大棚中，采集葉脈褪綠、黃化的番茄葉片，分別編號(hào)為T(mén)-ZZ、T-ZM、T-XZ、T-JY和T-FG，并同時(shí)采集相應(yīng)大棚中健康番茄葉片作為陰性對(duì)照。

1.1.2 生化試劑 TRIzol 購(gòu)自 Invitrogen公司；RTase M-MLV（RNase H-）、RNase Inhibitor 購(gòu)自Promega公司；凝膠回收純化試劑盒、Taq酶和DL2000 Marker均購(gòu)自杭州博日科技有限公司；dNTPs和 T4 DNA Ligase 購(gòu) 自 TaKaRa公 司；GeneFinderTM購(gòu)自廈門(mén)百維信生物科技有限公司。

1.1.3 菌株和載體 大腸桿菌（Escherichia coli）

DH5α菌株由鄭州市蔬菜生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體pMD18-T 購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 植物總RNA提取 采用TRIzol提取法，取番茄葉片樣本約0.1 g，在液氮中研磨后迅速轉(zhuǎn)移到 1.5 mL DEPC 處理的離心管中，加入 1 mL TRIzol試劑，振蕩均勻放置室溫 5 min 后 12 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的DEPC處理的1.5 mL離心管中，加入0.2 mL氯仿混勻，室溫放置10 min后再次12000 r·min-1離心15 min，仍將上清液轉(zhuǎn)移到DEPC處理的離心管中，加入0.5 mL異丙醇混勻，-20 ℃靜置30 min后12000 r·min-1離心10 min，用75%乙醇洗滌沉淀，最后用無(wú)核酶的去離子水溶解。置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增、序列克隆和測(cè)序 根據(jù)Dovas等（2002） 的 方 法 檢 測(cè)ToCVHSP70h部分基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物ToC-5（5′-GGTT TGGATTTTGGTACTACATTCAGT-3′） 和 ToC-6（5′-AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTC-3′），對(duì)獲得的植物總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

在DEPC處理的離心管中加入總RNA 5.0 μL，10 μmol·L-1ToC-6引 物 1.0 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL，用無(wú)核酶的超純水補(bǔ)充總體積至10 μL，70 ℃變性10 min，立即冰上放置2 min；再加入5×M-MLV Buffer 5.0 μL，200 U·μL-1RTase M-MLV（RNase H-）1.0 μL，40 U·μL-1RNase Inhibitor 0.5 μL，用無(wú)核酶的超純水補(bǔ)充總體積至25 μL，37 ℃水浴60 min。

以獲得的cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增ToCV編碼的HSP70h基因部分序列。PCR反應(yīng)體系（25 μL） 如 下：cDNA 5.0 μL，5 U·μL-1TaqDNA Polymerase 1.0 μL，ToC-5和 ToC-6引 物 各 1.0 μL，10×buffer 2.5 μL，ddH2O 補(bǔ) 充 至 25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，加入loading buffer和GeneFinder后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在可見(jiàn)光透視儀上顯示電泳結(jié)果。經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后，將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體（TaKaRa），陽(yáng)性克隆經(jīng)驗(yàn)證后送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序的HSP70h基因部分序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，登錄號(hào)為KR150985。

1.2.3 序列比對(duì)分析 利用NCBI序列比對(duì)工具BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分 析克隆獲得的序列，根據(jù)相似性確定病毒種類(lèi)，并與國(guó)際上報(bào)道的ToCVHSP70h的序列進(jìn)行序列相似性分析，這些報(bào)道的ToCV分離物及其GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)分別為美國(guó)分離物（登錄號(hào)：HQ879846），日本分離物（登錄號(hào)：AB513442），韓國(guó)分離物（登錄號(hào)：KP114528），中國(guó)山東分離物（登錄號(hào)：KC709510）、南京分離物（登錄號(hào)：KJ815045）及北京分離物（登錄號(hào)：KC887999）。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似感染ToCV番茄病株葉片癥狀

田間疑似感染ToCV病株的主要癥狀為植株下部葉片黃化，葉脈濃綠而葉脈間出現(xiàn)褪綠癥狀（圖1），嚴(yán)重時(shí)全株葉片褪綠并黃化。

圖1 疑似感染ToCV番茄病株下部葉片癥狀

2.2 ToCV分子檢測(cè)

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用ToCVHsp70h基因特異性引物對(duì)河南省鄭州、中牟、新鄭、濟(jì)源和扶溝地區(qū)疑似典型癥狀的番茄樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，在5個(gè)地區(qū)樣品中均擴(kuò)增到與ToCVHsp70h大小一致的約460 bp的條帶（圖2）。表明樣品可能被ToCV侵染。

圖2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 序列分析

將PCR擴(kuò)增得到的約460 bp片段的河南省5個(gè)地區(qū)分離物樣品純化、克隆到pMD18-T載體并進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)同源性比較，5個(gè)地區(qū)的測(cè)序產(chǎn)物同源性達(dá)99.1%以上，選鄭州測(cè)序樣品，在核苷酸序列水平上與GenBank上登錄的ToCV的相似性進(jìn)行比對(duì)，相似性均在99%以上，其中河南省的ToCV的HSP70h的序列與來(lái)自日本和韓國(guó)的HSP70h序列相似性達(dá)100%，與來(lái)自美國(guó)、中國(guó)山東、北京及南京等的HSP70h序列相似性為99.8%（表1）。表明河南省這5個(gè)地區(qū)的樣品均感染ToCV，ToCV是引起河南省番茄葉片褪綠黃化的重要病原之一。

表1 ToCV HSP70h鄭州分離物同源性比較 %

3 結(jié)論與討論

ToCV是番茄生產(chǎn)上的重要病害之一，感染該病毒病的番茄葉片變脆、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量下降，果實(shí)小、口感差，商品性下降。該病在國(guó)外已經(jīng)有報(bào)道，在我國(guó)最近幾年被發(fā)現(xiàn)，并在北京、山東地區(qū)均有發(fā)生（趙黎明 等，2014；趙汝娜 等，2014）。ToCV引起的植物葉片褪綠黃化癥狀與缺素癥狀相似，在病害調(diào)查中很容易誤判，且有潛伏侵染的特性，幼苗感染病毒初期有時(shí)不顯癥，3周后才能顯現(xiàn)癥狀，增加了該病毒通過(guò)種苗調(diào)運(yùn)傳播擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)針對(duì)該病毒的診斷主要通過(guò)癥狀觀察結(jié)合分子生物學(xué)方法，血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)尚未應(yīng)用。本試驗(yàn)通過(guò)分子生物學(xué)的方法，對(duì)河南省5個(gè)地區(qū)的番茄葉片疑似癥狀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明ToCV為導(dǎo)致河南省番茄葉片褪綠黃化的病原之一，這是該病毒的分子鑒定在河南省番茄上的首次報(bào)道。

ToCV主要伴隨煙粉虱等媒介昆蟲(chóng)發(fā)生為害，且該病毒能夠與番茄黃化曲葉病毒混合侵染，因此防控措施主要圍繞媒介昆蟲(chóng)來(lái)開(kāi)展。近幾年，由粉虱傳播的病毒病給我國(guó)的番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失，其中由TYLCV等一些雙生病毒引起的番茄黃化曲葉病毒病是我國(guó)番茄生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病毒病害，生產(chǎn)上已經(jīng)通過(guò)推廣具有抗病毒基因TY1、TY2和TY3a等的抗病品種防治TYLCV，得到一定的防治效果。利用分子生物學(xué)技術(shù)，筆者對(duì)參試的樣品進(jìn)行了抗病基因的分子標(biāo)記，所采集樣品均存在TY1和TY3a連鎖標(biāo)記基因位點(diǎn)，在生產(chǎn)中對(duì)TYLCV有一定的抗性，但對(duì)ToCV不表現(xiàn)抗性。

ToCV作為新病毒病害在我國(guó)的研究還處于初始階段，由于ToCV病毒傳播迅速，加之缺乏高抗ToCV的品種，亟須在番茄的種質(zhì)資源中篩選抗ToCV的種質(zhì)資源培育抗病毒品種。本試驗(yàn)僅僅對(duì)河南省5個(gè)市（縣）的ToCV進(jìn)行了分子檢測(cè)和鑒定，需要進(jìn)一步對(duì)各地ToCV的病毒株系的變異進(jìn)行鑒定和分析，加強(qiáng)對(duì)該病毒在不同地區(qū)的變異及分布、流行區(qū)域監(jiān)控及病毒防治技術(shù)等方面的研究。

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