黃瓜根際土壤細菌群落的16S rDNAPCR-DGGE分析

趙柏霞 閆建芳 劉 秋 于基成 趙秀香

（1大連市農業科學研究院，遼寧大連 116036；2沈陽農業大學植物保護學院，遼寧沈陽 110161；3大連民族大學生命科學學院，遼寧大連 116600）

黃瓜枯萎病〔Fusarium oxysporum（Schl） f. sp.cucumerinum〕是黃瓜生產上的一種頑固土傳病害，是目前造成我國瓜類生產上大面積減產的主要原因之一，是黃瓜病害中最為嚴重、造成經濟損失最大的病害之一（張宏宇 等，2010，閆霜 等，2011）。其致病菌可以在土壤中存活多年，給該病害的防治帶來很大的困難。黃瓜枯萎病的發生及發病程度的輕重，是病原菌和土壤中各種微生物相互作用的結果（鄧曉 等，2012）。土壤微生物多樣性與植物土傳病害抑制水平密切相關，根際微生物在抑制土傳病害和促進植物生長過程中具有重要的作用（Garbeva et al.，2004a，2004b； 申衛收和林先貴，2011）。PCR-DGGE技術作為一種指紋分析技術，適合用來分析環境微生物種群多樣性。近些年來，DGGE技術已經在環境微生物研究領域中廣泛應用（李懷 等，2008；馬俊孝 等，2008；潘雪蓮 等，2009；Chong et al.，2009；劉曉燕 等，2014）。

為揭示枯萎病菌對黃瓜根際細菌群落的影響，本試驗以黃瓜根際土壤總DNA為模板，采用PCRDGGE分析方法監測接種枯萎病菌后黃瓜根際土壤細菌的變化，試圖闡述在枯萎病菌影響條件下土壤細菌群落的演替規律，為從根際微生物生態角度理解枯萎病問題，進而為開展生物防治奠定 基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 試驗所用的黃瓜枯萎病病原菌——尖孢鐮孢菌黃瓜專化型（Fusarium oxysporumf. sp.cucumerinum），由大連民族大學實驗室保存。

1.1.2 供試土壤樣品采集 試驗田設在大連民族大學的溫室內，2012年 4月，將從大連當地種子店購買的黃瓜品種碧秀的種子催芽后，播種在直徑30 cm的大花盆中。待黃瓜3～4片葉時，接種黃瓜枯萎病菌。采用抖落法（張學利 等，2005）分別采集黃瓜種植前的土壤（ZQ，4月18日取樣）、接種黃瓜枯萎病菌前的土壤（JQ，5月20日取樣）、接菌后感染枯萎病菌的黃瓜根際土壤（JB，6月17日取樣）、接菌后未發病的黃瓜根際土壤（JJ，6月17日取樣）及接種清水的黃瓜根際土壤（CK，6月17日取樣）共5份黃瓜根際土壤樣品。每份樣品由5株黃瓜根際土壤充分混勻。樣品取回后置于陰涼通風處干燥，過20目篩后備用。

1.2 方法

1.2.1 樣品總 DNA 的提取 采用堿裂解法提取供試土壤樣品總 DNA（Hu et al.，2010），用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢驗，以λ-Hind Ⅲ作為 Marker。

1.2.2 PCR擴增 采用兩輪PCR反應，引物見表1。第1輪PCR擴增以提取的土壤總DNA為模板，采用細菌 16 S rDNA 的通用引物 F27/R1492 進行擴增。反應體系及程序參考韋超英等（2011）的方法。第2輪PCR反應，采用 F338-GC/R518引物擴增細菌 16 S rDNA V3 區。反應體系 50μL，參照楊尚東等（2014）的方法進行。PCR反應程序：94 ℃ 預變性 5 min；94 ℃變性 30 s，63 ℃（后 20 個循環每個循環降 0.5 ℃直至降到 53 ℃）退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 40 個循環；72 ℃延伸 7 min；擴增產物4 ℃保存。

表1 PCR 引物

1.2.3 DGGE 分析 采用 Bio-Rad 電泳系統。變性劑梯度為 30%～60%的 8%聚丙烯酰胺凝膠，60 ℃、80 V 條件下電泳 10 h。膠用 sybr green Ⅰ染色 30 min，DGGE 條帶用 Quantity One 軟件分析。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取

采用堿裂解法提取的總DNA，通過與λ-Hind Ⅲ Marker比較，可以看出由該方法獲得的5個土壤樣品的總DNA片段大小超過23.1 kb，形成了較亮的清晰條帶，并且DNA片段的產量大，可以進行后續試驗（圖1）。

2.2 PCR 擴增

第1輪PCR反應以F27/R1492為引物，得到大小約為1 500 bp的目的片段（圖2），PCR產物的特異性較好。第2輪PCR反應以F338-GC/R518為引物，擴增得到大小約為230 bp的目的片段（圖3）。

圖1 根際土壤總DNA電泳結果

圖2 各樣品16S rDNA擴增結果

圖3 各樣品16S rDNA基因V3區擴增結果

2.3 DGGE分析

對各樣品 16S rDNA V3 區 PCR 產物進行 DGGE 分析（圖4）。每個土壤樣品都檢測到了不同數目的條帶，從15個條帶（CK）到24個條帶（JJ）不等，它們之間的帶型也各不相同。接種清水的對照土壤樣品（CK）有15個條帶，細菌多樣性最低，接菌后未發病的土壤樣品（JJ）條帶數最多，細菌多樣性最高。

采用Quantity one軟件分析表明，只有少數條帶為個別樣品的特異性條帶，如條帶E1、E5及E6；多數條帶如條帶E2、E4，在各個樣品中普遍存在。這說明樣品之間既存在著相似的細菌種群，又具有其特異的細菌種群。

圖4 PCR 產物的 DGGE 電泳圖譜

2.4 序列測定

從5份土壤樣品總DNA擴增得到不同數目的 16S rDNA V3 區條帶，選擇各樣品特有的或共有的、并有一定亮度的9 個條帶，回收測序，測序后與 GenBank 數據庫序列進行比對。由表2可知，條帶 A1、A2、E2、E4、E5的序列均與未培養細菌種屬相似性較高，分別屬于酸桿菌門（Acidobacteria）、 擬 桿 菌 門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、放線菌門（Actinobacteria），這些未培養種群大多從污染土壤、植物根際土壤中獲得。其余幾個條帶與可培養細菌相似度較高，B1與Sphingomonassp.相似性達 100%。結合圖4可以看出，B1條帶所對應的細菌是在種植前的土壤樣品（ZQ）中數量較多，在接種枯萎病菌后的各土壤樣品（JB、JJ）中數量則有所降低。E3、E6的序列都和Clostridiumsp.相似性較高。本試驗中，接種枯萎病菌后Rhodococcus

表2 DGGE主要條帶的測序比對結果

phenolicus（E1）、Clostridiumsp.（E3、E6） 以 及3種未培養細菌（E2、E4、E5）數量增加，另外2種未培養細菌（A1、A2）數量減少。

3 結論與討論

本試驗中，從不同樣品的DGGE電泳圖譜可以看出，每個樣品均可以分離到15～24個不等條帶，不同的條帶代表不同細菌的基因片段，表明每個樣品都存在著豐富的微生物種類。條帶最少的是接種清水的對照土壤（CK），條帶最多的是接種枯萎病菌后未發病的土壤樣品（JJ），表明接種后未發病的土壤樣品中細菌多樣性較高。分析其原因，可能是接種枯萎病菌后誘導了一些微生物數量的增加，進而使土壤中微生物的豐富性升高；接菌后枯萎病菌與土壤中其他微生物產生了競爭作用，最終未發病可能是有益微生物的數量和種類占了優勢。這一結果與張鈺等（2013）的研究報道相似，即對黃瓜幼苗施用菌劑后，能使根圍和根際中細菌和放線菌的數量升高。

DGGE 條帶數目可以近似地體現細菌種群的數量，而條帶亮度則反映該種細菌數量的多少（Hu et al.，2004）。本試驗中，接種枯萎病菌使根際土壤部分細菌的數量發生了明顯變化，這體現在條帶亮度增強或減弱上，如條帶E1、E4在樣品JB、JJ中亮度增強，這說明接種枯萎病菌后使得E1、E4所代表的細菌種群在根部富集。

DGGE 指紋圖譜提供了細菌群落結構變化趨勢，為了進一步了解細菌群落結構的組成，對DGGE 特殊條帶進行切膠回收測序。從9個 DGGE 條帶測序結果看，這些條帶對應同源性最高的微生物分別屬于變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）以及放線菌門（Actinobacteria）。這些微生物多為未培養微生物，表明接種枯萎病菌對土壤中大量未培養細菌的影響較大，但由于這些細菌還未被培養或不可培養，因此很難鑒定它們在原位生態環境中的生理生化特性及其所具備的生態功能意義。

從DGGE圖譜可以看出，接菌前（JQ）和對照（CK）中E4、A2條帶發生了變化，由于對照是在接種清水后、在植株生長后期取的樣品，這就說明隨著黃瓜的生長發育，也就是說黃瓜的不同生育期，根際土壤中細菌群落會發生改變。接種病原菌（JJ、JB）使得E1、E3、E4、E5條帶亮度增強，也會引起A1、A2條帶亮度的降低。其中E1、E3分 別 與Rhodococcus phenolicus、Clostridiumsp.相似性達到99%，文獻報道Rhodococcus phenolicus是一種硝化細菌（張光亞 等，2003），Clostridiumsp.是一種典型的產氫菌（許繼飛 等，2009），這兩種菌和植物病害的具體關系均未見報道。

在除了ZQ樣品以外的4個樣品中，Sphingomonassp.（B1）數量減少，這說明種植黃瓜后引起了該種細菌的數量變化，Sphingomonas屬的一個顯著特征是可以降解多環或單環芳香族化合物如苯甲酸、水楊酸等，它能利用這些芳香族化合物為唯一碳源進行生長（Basta et al.，2005），而苯甲酸、水楊酸及其衍生物是黃瓜根系分泌物中的重要化感物質（Pramanik et al.，2000）。本試驗得到的細菌群落 DGGE 圖譜與胡元森等（2007）研究結果不一致，胡元森研究發現，黃瓜連作引起土壤中Sphingomonassp.數量增加。本試驗后期接入了枯萎病菌，而胡元森研究的是連作黃瓜的根際土壤，這似乎說明根際土壤中細菌群落受病菌影響較大。

有研究表明，根系分泌物是由多種物質組成，包括各種低分子有機物、各種離子等（羅永清 等，2012）。根系分泌物會改變根際細菌群落組成（Kozdroj & van Elsas，2000），添加根系分泌物能有效促進細菌的生長（T é cher et al.，2011）。而根系分泌物也受到各種因素的影響，如芳香族化合物等有機物質（Hoang et al.，2011）、真菌侵染（Norman & Hooker，2000）、金屬元素（Meier et al.，2012）等。本試驗中，DGGE 9個主要條帶所代表的細菌并未發現與黃瓜枯萎病的發生有著明顯的關聯，但是，枯萎病菌的接入可能是通過改變黃瓜根系分泌物的產生或者其中的各種離子成分等進而改變了黃瓜根際的生態環境，從而影響了根際的細菌群落組成，還有待進一步研究。

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