根結線蟲侵染對不同抗性番茄品種葉片葉綠素含量及其熒光參數的影響

李媛媛 王冰林 錢 程 胡玉榮 鄭慧敏

（1山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，濰坊學院生物與農業工程學院，山東濰坊 261061；2濰坊市農業科學院，山東濰坊 261071）

根結線蟲是為害作物生產最嚴重的病害之一，能夠侵染包括番茄在內的2 000多種植物（Vasyukova et al.，2009）。我國設施番茄栽培因為連作重茬、復種指數高等原因，根結線蟲發生非常嚴重甚至成為流行性病害（李君明 等，2003；李紅雙 等，2006）。根結線蟲侵染首先侵入植物根部伸長區，然后逐漸遷移至根部維管束，建立取食地點，破壞維管組織，從而影響植物根系對水分和營養的吸收（Abad et al.，2003）。Dorhout 等（1991）報道，根結線蟲侵染導致番茄植株對水分的吸收減少，地上部出現生長遲緩、萎蔫及黃化現象。根結線蟲侵染也會顯著影響植物的保護酶活性、葉片水勢、光合作用、呼吸作用、物質代謝等過程（Poskuta et al.，1986；Rahi et al.，1988；Ramakrishnan & Rajendran，1998；郭衍銀 等，2005；李媛媛 等，2011；梁朋 等，2012；Strajnar et al.，2012；王冰林 等，2013）。雖然有關根結線蟲侵染對植株生理生化特征的影響研究較多，但是根結線蟲侵染后，番茄葉片葉綠素熒光參數的變化卻鮮有報道。本試驗以兩個不同根結線蟲抗性的番茄品種為試材，通過根結線蟲侵染過程中葉片葉綠素含量和葉綠素熒光參數的變化，分析線蟲侵染與葉片生理指標變化的關聯性，為篩選抗根結線蟲番茄品種提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄（Solanum lycopersicumL.）品種為世佳101和精選紅桃，由濰坊市農業科學院提供。經分子標記檢測（Williamson et al.，1994），兩個品種均不含Mi-1基因。供試南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）采自濰坊市農業科學院試驗基地，經鑒定后，利用活體番茄苗保種、擴繁。

1.2 試驗方法

1.2.1 世佳101和精選紅桃根結線蟲抗性鑒定 試驗于2011年1～6月在濰坊學院試驗基地日光溫室中進行。用2%的NaClO溶液浸種30 min，對供試番茄種子進行消毒，用無菌水沖冼3次后，置于培養皿中30 ℃催芽。催芽后將其播種至內含蔬菜育苗專用基質的72孔育苗穴盤中進行正常培養。待幼苗長至三葉一心時移植于直徑8 cm、高17 cm的塑料杯中，每杯1株，杯內栽培基質（砂∶土=1V∶ 2V）經過高溫滅菌處理。

番茄苗長至四葉期后，選擇長勢相同且生長優良的植株，在根周圍用打孔器打孔（每杯打5孔），注入根結線蟲二齡幼蟲（2 000條·杯-1），然后用土掩埋（李媛媛 等，2011）。兩個品種各接種15株，以注入清水為對照，3次重復。培養40 d后，參照Garabedian和 van Grundy（1983）的分級標準，調查每株番茄苗的根結等級，計算病情指數，鑒定抗性等級（白春明 等，2010）。

1.2.2 葉綠素含量和葉綠素熒光參數的測定 試驗于2012年1～6月在濰坊學院試驗基地日光溫室中進行。番茄苗培養和線蟲接種均同1.2.1。兩個品種各接種15株，以注入清水為對照，3次重復。分別在接種后 0、5、10、15、20 d和 25 d，利用PAM-2100型脈沖調制式葉綠素熒光儀測定番茄功能葉片的葉綠素熒光參數，包括最大光化學效率（Fv/Fm）、光合電子傳遞效率（ΦPSⅡ）和非光化學猝滅系數（NPQ）。測定結束后，選取相應節位的葉片保存于超低溫冰箱中，用于測定葉綠素含量。用80%丙酮將葉片研磨、萃取、過濾定容后，以80%丙酮為對照，在紫外-可見分光光度計上分別測定OD663和OD645。葉綠素a （Chla） 和葉綠素b （Chlb）含量計算公式參考張志良等（2010），并分別計算Chl（a+b）含量和Chla/b值。

1.2.3 數據分析 數據處理和圖形繪制采用Microsoft Excel 2003 軟件，方差分析采用 SPSS 11.5軟件。

2 結果與分析

2.1 番茄品種抗性鑒定

苗期接種鑒定結果表明：兩個番茄品種存在明顯抗性差異，世佳101根結等級為5.0，病情指數達到100，屬于高感根結線蟲品種；精選紅桃根結等級為2.6，病情指數為40，屬于中抗根結線蟲 品種。

表1 根結線蟲侵染對番茄葉片葉綠素含量的影響

2.2 南方根結線蟲侵染對番茄葉片葉綠素含量的影響

如表1所示，在未接種的材料中，精選紅桃的Chla含量比世佳101高15.7%，二者差異顯著；接種根結線蟲15 d后，與清水對照相比，兩個品種的Chla含量均顯著下降，但精選紅桃下降幅度低于世佳101。兩個番茄品種的Chlb含量在未接種的材料中差異顯著。接種根結線蟲后，精選紅桃植株Chlb含量變化較小，差異均未達到顯著水平；世佳101接種植株Chlb含量在接種20 d后開始顯著降低，到接種25 d時，比清水對照降低26.9%。在未接種的材料中，兩個番茄品種的Chl（a+b）含量不存在顯著差異。在接種根結線蟲20 d后，精選紅桃植株葉片Chl（a+b）含量開始顯著下降，而世佳101植株葉片在接種15 d后即開始顯著下降。未接種材料的Chla/b值一直比較穩定，抗病材料精選紅桃葉片Chla/b值是感病材料世佳101的1.43倍。線蟲侵染后，兩個番茄品種的Chla/b值呈現出不同程度的降低。以上結果表明，線蟲侵染會導致番茄葉片葉綠素降解，但是抗性品種的葉綠素降解幅度顯著低于高感品種，即抗性品種在線蟲侵染后其葉綠素含量仍能穩定在較高水平，以盡可能維持正常的光合性能。

2.3 南方根結線蟲侵染對番茄葉片葉綠素熒光參數的影響

葉綠素熒光參數Fv/Fm反映了PSⅡ的最大光化學效率，是光抑制程度的一個重要指標。利用葉綠素熒光儀測得根結線蟲侵染后番茄葉片Fv/Fm的變化趨勢如表2。清水對照的兩個番茄品種的 Fv/Fm一直恒定在0.81左右。線蟲侵染前期，該參數變化較小，在接種20 d后，世佳101與清水對照相比顯著下降；精選紅桃則在接種后25 d才開始顯著下降。以上結果表明，在接種后期兩個品種均發生光抑制，且世佳101的光抑制強度更高。

葉綠素熒光參數ΦPSⅡ表示實際光化學效率，其值升高或降低反映植物光合碳同化的促進或抑制程度。在清水對照中，兩個番茄品種的ΦPSⅡ在整個試驗時期內不存在顯著差異（表2）。在接種根結線蟲前期，兩個品種的ΦPSⅡ變化幅度較小。接種后15 d，ΦPSⅡ均開始顯著下降，且世佳101下降幅度大于精選紅桃；ΦPSⅡ到接種后25 d達到最低值，世佳101和精選紅桃分別比清水對照下降26.0%和10.2%。結果表明，番茄葉片光合碳同化過程由于線蟲的侵染出現了不同程度的抑制，并且世佳101的抑制程度大于精選紅桃。

葉綠素熒光參數NPQ值的升高可以保護光合系統免受損害，以盡可能維持植物的光合性能。根結線蟲侵染后，兩個品種葉片的NPQ先呈現上升趨勢，且精選紅桃上升幅度大于世佳101，侵染10 d時兩個番茄品種的NPQ出現顯著差異；在接種25 d后NPQ突然顯著下降，但精選紅桃的接種植株葉片NPQ仍顯著高于清水對照（表2）。

表2 根結線蟲侵染對番茄葉片葉綠素熒光參數的影響

3 結論與討論

根結線蟲侵染番茄植株后，抗病品種和感病品種的葉綠素含量總體呈逐漸下降趨勢，且抗病品種的降低幅度明顯低于高感品種。同時，線蟲侵染對番茄葉片葉綠素熒光特性造成明顯影響。其中 Fv/Fm和ΦPSⅡ隨著根結線蟲侵染時間的延長呈現下降趨勢，高感品種出現顯著降低的時間要早于抗病品種，降低幅度也大于抗病品種。葉綠素熒光參數NPQ隨根結線蟲侵染呈現先上升再下降的趨勢，抗病品種的上升程度大于感病品種，在接種10 d后，抗感品種的NPQ值出現顯著差異。上述研究結果表明，線蟲侵染后，中抗品種精選紅桃能夠保持較高的葉綠素含量，光抑制和碳同化過程受影響較小，且熱耗散能力較強，從而使精選紅桃植株生長受線蟲侵染影響較小。

本試驗發現，根結線蟲侵染導致兩個番茄品種的葉綠素含量下降，與前人的研究結果基本一致（Wang et al.，2004；Bilgin et al.，2010；葉德友 等，2011；Korayem et al.，2012）。高感根結線蟲品種世佳101葉綠素含量降低幅度明顯高于中抗品種精選紅桃，也與前人的研究一致。葉德友等（2011）發現線蟲侵染后抗病材料葉綠素含量的降低幅度顯著小于感病材料。Chaerle等（2007）認為通過監控被病菌侵染后植物葉片葉綠素含量的降低程度可以反映植物對病原菌的抗性程度，從而實現對抗、感植株的篩選。

測定葉片葉綠素含量會對植株造成一定損傷，且程序繁瑣，應用葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數的變化，可以實現對植株葉片光合性能的無損檢測。本試驗測定了根結線蟲侵染過程中不同抗性番茄品種的葉綠素熒光參數的動態變化。其中，Fv/Fm表現最穩定，在接種早期基本恒定在0.81左右，直到接種20 d后高感品種才出現顯著下降。Rahi等（1988）研究表明，線蟲侵染會損傷植物根系，影響植株水分吸收，形成葉片生理性缺水，致使葉片氣孔部分關閉。Baker和Rosenqvist（2004）認為水分脅迫早期葉片氣孔的部分關閉會導致CO2的吸收量減少，影響光合作用的暗反應，但不會影響PSⅡ，因此Fv/Fm變化不大；水分脅迫后期，水分的進一步匱缺會導致Fv/Fm出現下降趨勢（Jansen et al.，2009；Mishra et al.，2012）。ΦPSⅡ和NPQ在接種初期基本保持穩定，可能意味著葉片吸收的光能能夠被暗反應和光呼吸作用完全利用（M ü ller et al.，2001；Ort & Baker，2002）。Omasa和Takayama（2003）研究報道，無論氣孔關閉與否，NPQ和ΦPSⅡ都不會發生改變，但如果在強光照射下NPQ和ΦPSⅡ會出現明顯的上升和下降趨勢。本試驗中，與清水對照相比，番茄植株葉片自接種后15 d開始，ΦPSⅡ出現了顯著下降；NPQ則分別在接種10 d（精選紅桃）和15 d（世佳101）后出現了顯著上升，可能表明葉片吸收的光能不能夠被CO2固定和光呼吸途徑充分利用，非光化學機制被快速啟動。NPQ值的升高可以保護光合系統免受損害，以盡可能維持植物的光合 性能。

大量研究表明，葉綠素熒光參數能夠穩定遺傳， 并 且 前 人 已 在 小 麥（Czyczy?o-Mysza et al.，2013）、玉米（?imi? et al.，2014）等作物中對葉綠素熒光參數進行了QTL定位，開展了相關分子基礎等方面的研究。綜合本試驗結果，通過檢測葉綠素熒光參數Fv/Fm、ΦPSⅡ和NPQ的變化，可以無損、便捷地提供番茄抗感根結線蟲的相關信息，并且由于NPQ在接種材料中出現差異的時間最早，因此NPQ可能是一個更適合于在田間無損檢測番茄抗感根結線蟲材料的葉綠素熒光參數。但葉綠素熒光參數的測定受諸多因素影響，因此關于NPQ的田間適用性還有待于進一步試驗研究。

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