硫酸銨梯度法制備重酒石酸長春瑞濱脂質體及其在大鼠體內的藥動學參數

鄭召磊，李亞平，，陳伶俐

（1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮江212013；2.中國科學院上海藥物研究所藥物制劑中心，上海201203）

硫酸銨梯度法制備重酒石酸長春瑞濱脂質體及其在大鼠體內的藥動學參數

鄭召磊1，李亞平1，2，陳伶俐2

（1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮江212013；2.中國科學院上海藥物研究所藥物制劑中心，上海201203）

目的：采用硫酸銨梯度法制備重酒石酸長春瑞濱脂質體，并研究其理化性質及在大鼠體內的藥動學行為。方法：采用硫酸銨梯度法制備重酒石酸長春瑞濱脂質體，并考察其形態、粒徑、包封率、穩定性；采用HPLC測定長春瑞濱在大鼠體內的血藥濃度。結果：重酒石酸長春瑞濱脂質體的平均粒徑為（88.7±11.2）nm（n=3）；包封率為（90.71±0.16）%（n=3）；在10%胎牛血清中48 h釋放率低于20%；SD大鼠尾靜脈注射重酒石酸長春瑞濱脂質體后，藥物半衰期為（5.38±0.29）h；AUC0→t=（98.11±0.12）mg·h-1·L-1。結論：重酒石酸長春瑞濱脂質體包封率較高，在血清中的穩定性良好，能夠顯著延長體內循環時間，提高其生物利用度。

重酒石酸長春瑞濱；脂質體；硫酸銨梯度法；藥動學

長春瑞濱（vinorelbine）是一種半合成的長春生物堿類抗腫瘤藥物，其作用機制是阻止細胞有絲分裂過程中微管的形成，使細胞分裂停止在分裂中期。臨床上多將該藥作為治療非小細胞肺癌的首選藥物，并廣泛用于治療乳腺癌、卵巢癌、惡性淋巴瘤等［1］。骨髓抑制、白細胞下降、胃腸道反應等不良反應使其在臨床中的應用受到限制［2］。

脂質體作為抗腫瘤藥物的載體，能靶向增加藥物在腫瘤組織中的蓄積，并減少藥物在正常組織中的分布，從而具有增強療效、降低毒性的作用［3-4］。實驗室微量制備長春瑞濱脂質體多采用成膜法和擠出法［5-6］。硫酸銨梯度法是利用脂質體膜內外硫酸銨的濃度梯度差，實現對藥物的主動包裹，操作簡單方便。因此，本研究采用硫酸銨梯度法結合高壓均質法制備長春瑞濱脂質體，并考察其理化性質及其在大鼠體內的藥動學行為，為長春瑞濱的臨床應用開創一個更廣闊的前景。

1 儀器與試藥

Angilent1100型高效液相色譜儀（美國Angilent公司）；Nano-ZS90型粒徑測定儀（英國Malvern公司）；Mili-Q純水儀（美國Millipore公司）；JEM-2000Ex型透射電鏡（日本Jeol公司）；M110-EH型均質機（美國Microfluidics公司）；透析袋（美國Sigma公司，截留相對分子質量8 000～14 000）。

長春瑞濱原藥（廣州白云山漢方現代藥業有限公司，含量＞99%，批號B4140030）；氫化磷脂（批號RKL-MD231）；膽固醇（南京新百藥業有限公司，批號131101）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000，上海艾偉特醫藥科技有限公司，批號B20204）；葡聚糖凝膠Sephadex G-50（美國GE公司，批號17004301）；胎牛血清（美國Gibco公司）；甲醇為色譜純（德國默克公司），無水乙醇為分析純。

健康雄性SD大鼠，體質量（200±10）g，清潔級，由中國科學院上海藥物研究所二期實驗動物中心提供。

2 方法與結果

2.1 脂質體的制備

2.1.1 空白脂質體的制備 稱取處方量氫化磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000，置具塞錐形瓶中，加入適量無水乙醇，超聲使完全溶解，得脂質乙醇溶液。70℃條件下，將脂質乙醇溶液加入到60 mL硫酸銨溶液（300 mmol/L）中，經剪切分散后，高壓均質形成空白脂質體初液。采用透析法除去脂質體外水相硫酸銨。

2.1.2 脂質體的載藥 取空白脂質體10 mL，按藥脂比（1∶10，w/w）滴加長春瑞濱水溶液，60℃恒溫條件下孵育10 min，得濃度約為1 mg/mL的長春瑞濱脂質體。

2.2 長春瑞濱脂質體的透射電鏡形態觀察

取上述制備的脂質體加水適當稀釋，采用2%磷鎢酸負染后，用透射電鏡觀察形態（圖1）。可見脂質體大小均一，均呈現規則球形或近球形。

2.3 長春瑞濱脂質體的粒度分布

取上述脂質體于測量池中，加水適量稀釋后，采用粒徑測定儀測定其粒徑及分布。測定結果顯示，脂質體平均粒徑為（88.7±11.2）nm（n=3），粒徑分布指數（PDI）為0.129，粒徑分布較均勻（圖2）。

圖1 長春瑞濱脂質體的形態（透射電鏡）

圖2 長春瑞濱脂質體的粒度分布

2.4 長春瑞濱脂質體包封率的測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters X-BridgeTMC18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：0.05mol/L PBS（取磷酸二氫鉀6.8 g，加水至800 mL溶解，加三乙胺10 mL，磷酸調pH至4.0，加水至1 L）∶乙腈（60∶40）；檢測波長：267 nm；柱溫：40℃，流速：1.0 mL/min；進樣量：20μL。

2.4.2 檢測方法的方法學驗證 精密稱取長春瑞濱適量，以甲醇為溶劑，配制濃度為1，10，50，100，200和400 mg/L的溶液，按“2.4.1”項下條件測定。得濃度（c）對峰面積（A）的線性回歸方程A= 20.818c-0.6481，r=0.999 7，表明在1～400 mg/L范圍內，濃度與峰面積具有良好的線性關系。

配制濃度為1，50，100 mg/L長春瑞濱溶液，分別進行日內和日間精密度考察。日內和日間RSD分別為1.10%，0.76%，0.56%和1.89%，0.80%，0.67%（n=5），RSD值均小于2%。

配制濃度為100 mg/L長春瑞濱溶液，精密量取1，2，3 mL于10 mL容量瓶中，加入處方量的空白脂質體，甲醇破乳并定容，得10，20，30 mg/L的樣品溶液，按“2.4.1”項下條件測定。計算得回收率分別為（99.60±0.31）%，（100.07±0.25）%，（100.23± 0.12）%，RSD值分別為0.30%，0.25%，0.12%（n=3）。

2.4.3 脂質體洗脫曲線的繪制 取葡聚糖凝膠Sephadex G-50適量，加水適量充分溶脹后，制備凝膠柱（1 cm×45 cm）。移液管量取長春瑞濱脂質體0.5 mL上柱，PBS（pH 7.4）洗脫，流速為0.8 mL/ min。用刻度EP管收集洗脫液，每管收集2 mL。不帶乳光的直接按“2.4.1”項下條件測定峰面積；有乳光的樣品加定量的甲醇破壞后，測定其峰面積。另配制濃度約為1 mg/mL的長春瑞濱溶液，量取0.5 mL上柱，每管2 mL，收集洗脫液。結果顯示，脂質體集中在12～22 mL部分，游離藥物集中在34～54 mL部分，脂質體部分與游離藥物能完全分離，見圖3。

圖3 長春瑞濱脂質體以及游離藥物洗脫曲線

2.4.4 葡聚糖凝膠法測定包封率 采用上述方法制備的凝膠柱，精密量取長春瑞濱脂質體0.5 mL上柱，根據洗脫曲線，收集脂質體部分（12～22 mL）洗脫液，置50 mL容量瓶中，用甲醇破乳并定容至刻度，再精密量取5 mL置10 mL容量瓶中，甲醇定容，按“2.4.1”項下條件測定，得脂質體中包裹的藥量W。另外精密量取脂質體0.5 mL置于50 mL容量瓶中，甲醇破乳并定容，再精密量取5 mL置10 mL容量瓶中，甲醇定容，同法操作，得脂質體中的總藥量W0。按公式包封率=W/W0×100%計算脂質體的平均包封率為（90.71±0.16）%（n=3）。

2.5 脂質體在胎牛血清中的釋放度

精密量取長春瑞濱脂質體懸液0.5 mL置透析袋中，并將透析袋兩端扎緊，置裝有釋放介質（10%胎牛血清溶液）20 mL的錐形瓶中，于搖床［（37± 0.5）℃、100次/min］中振蕩，分別在0.5，1，2，4，6，8，12，24，48，72，96，120和148 h取出全部介質（同時用同溫等量釋放介質替換原先釋放介質），按“2.4.1”項下條件測定，計算累積釋放率Q，同時以游離藥物為對照進行比較，以Q對時間（t）作圖，結果見圖4。結果顯示，在10%胎牛血清溶液中長春瑞濱從脂質體中釋放緩慢，48 h累積釋放率低于20%，表明長春瑞濱脂質體在胎牛血清中的穩定性良好；120 h后，長春瑞濱從脂質體中釋放完全。游離藥物在相同條件下6 h內就釋放96%以上，表明長春瑞濱脂質體具有顯著緩釋作用。

圖4 長春瑞濱脂質體以及游離藥物的體外釋放曲線

2.6 長春瑞濱脂質體的藥動學參數測定

2.6.1 藥動學色譜條件及方法學驗證 樣品采用高效液相色譜（HPLC）方法測定。色譜條件：按“2.4.1”項下條件。

取空白血漿100μL置1.5 mL離心管中，加入已知濃度的長春瑞濱甲醇溶液400μL，渦旋30 s后離心（相對離心率12 000×g）10 min，取上清液測定長春瑞濱濃度。得線性回歸方程為A=19.104c-18.271，r=0.9994，表明在0.25～80 mg/L的范圍內，濃度與峰面積具有良好線性關系。

長春瑞濱在0.25，40和80 mg/L血樣中的回收率分別為80.31%、84.33%和89.58%（n=3），均滿足分析方法的要求（＞75%）；日內和日間RSD分別為1.57%，0.89%，0.93%和2.83%，3.06%，2.12%（n=5），均滿足生物樣品的分析要求。

2.6.2 實驗方案和血樣處理 取SD大鼠8只，隨機分為兩組（每組4只）。將長春瑞濱注射液（加生理鹽水稀釋成1 mg/mL的溶液）或脂質體按10 mg/ kg（按長春瑞濱計）從尾靜脈注射入SD大鼠體內，分別于0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，10，12和24 h眼眶取血0.5 mL于離心管中（每管加10μL 1%的肝素鈉），離心（相對離心率5 000×g）5min，得上層血漿。取上述血漿樣品100μL置1.5 mL離心管中，加入甲醇400μL，渦旋30 s后離心（相對離心率12 000×g）10 min，取上清液測定血藥濃度。采用DAS 2.0藥動學軟件對血藥濃度數據進行計算。采用非房室模型以統計矩計算藥動學參數。

2.6.3 藥動學實驗結果 大鼠尾靜脈注射長春瑞濱脂質體或長春瑞濱溶液后的藥時曲線見圖5。藥動學參數見表1。

大鼠體內藥動學實驗表明，長春瑞濱脂質體的藥時曲線下面積（AUC0→t）和半衰期分別是長春瑞濱溶液的17.2和3.2倍。

圖5 長春瑞濱注射液以及脂質體的藥時曲線

3 討論

硫酸銨梯度法類似于pH梯度法，利用脂質體磷脂雙分子層兩側硫酸銨梯度差，實現對藥物的包封。其原理是內水相中氨分子擴散到外部，間接形成pH梯度，使藥物進入脂質體內［7-8］。硫酸銨梯度法適合于弱堿性藥物脂質體的制備，具有制備方法簡單、包封率高的特點。長春瑞濱是一種半合成的弱堿性類抗癌藥物。因此，本研究采用硫酸銨梯度法結合高壓均質法制備的重酒石酸長春瑞濱脂質體，粒徑均一，包封率高，穩定性好。

表1 脂質體與普通注射液主要藥動學參數比較 n=4

目前，常用的脂質體包封率測定方法包括超濾法、離心法和凝膠過濾法等。離心法所需轉速極高，條件苛刻，且不易分離游離藥物與脂質體；超濾法所使用的超濾管對長春瑞濱截留嚴重，測定誤差較大。本實驗所使用的葡聚糖凝膠過濾法，可以將游離藥物與脂質體完全分離，適合長春瑞濱脂質體包封率的測定，因此，測定結果準確可靠。

大鼠體內藥動學研究結果表明，與市售長春瑞濱注射液相比，脂質體可明顯延長藥物的生物半衰期，大大提高了AUC。這可能是因為脂質體處方中加入了長循環材料DSPE-PEG2000，PEG類化合物用于修飾脂質體可形成空間位阻，增加脂質體在血液中的穩定性，逃避網狀內皮系統的捕獲，從而延長脂質體在血液中的循環時間。

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Preparation and pharmacokinetics in rat of vinorelbine biartrate liposomes by ammonium sulfate gradientmethod

ZHENG Zhao-lei1，LIYa-ping1，2，CHEN Ling-li2
（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Center for Formulations System，Shanghai Institute ofMateria Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai201203，China）

Objective：To prepare vinorelbine bitartrate（NVB）liposomes by ammonium sulfate gradient method，and to study the properties and pharmacokinetics of NVB liposomes.M ethods：NVB liposomes were prepared by ammonium sulfate gradientmethod.The mean diameter of liposomes was determined by dynamic light scattering.Encapsulation efficiency was determined by sephadex column，pharmacokinetics was evaluated in SD rats.Results：Mean particle size and encapsulation efficiency of NVB liposomeswere（88.7±11.2）nm（n=3）and（90.71±0.16）%（n=3）.In addition，less than 20%of NVB liposomes was released in 48 hours.Themain pharmacokinetic parameters of NVB liposomes were as follows：t1/2=（5.38±0.29）h and AUC0→t=（98.11±0.12）mg·h-1·L-1.Conclusion：NVB liposomes exhibited high encapsulation efficiency.The pharmacokinetics of NVB liposomes showed prolonged elimination halflife and increased bioavailability.

vinorelbine biartrate；liposomes；ammonium sulfate gradientmethod；pharmacokinetics

R943 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0256-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140321

鄭召磊（1987—），男，碩士研究生；陳伶俐（通訊作者），高級工程師，E-mail：linglichen1872@hotmail.com

2014-12-10 ［編輯］ 陳海林