表面增強拉曼光譜法快速分析中藥三七的有效成分

衛程華，陳娟，許曼翎，戚雪勇

（江蘇大學藥學院，江蘇鎮江212013）

表面增強拉曼光譜法快速分析中藥三七的有效成分

衛程華，陳娟，許曼翎，戚雪勇

（江蘇大學藥學院，江蘇鎮江212013）

目的：建立表面增強拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）法快速分析中藥三七中的有效成分。方法：對三七藥材進行簡單的預處理，分別測試三七藥材粉末、三七水提和醇提樣品的表面增強拉曼光譜；再結合薄層色譜分離技術，測試三七醇提取樣品中單一有效成分的表面增強拉曼光譜，并對所獲得的圖譜進行解析。結果：直接測試三七藥材粉末、三七水提和醇提樣品的表面增強拉曼光譜有微弱信號；三七醇提取樣品經過TLC技術分離后的單一組分可獲得較理想的表面增強拉曼光譜。結論：建立的快速分析三七有效成分的表面拉曼光譜法具有簡便，快速，專屬性好，靈敏度高等特點，可拓展到其他中藥材的質量控制和分析鑒定中。

表面增強拉曼光譜；三七；快速分析

三七［Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen］，屬五加科人參屬多年生草本植物，為我國特有的名貴中藥材，分布在我國云南、廣西、江西、四川等地，主要藥用部位是其根部，具有散瘀止血，消腫定痛之功效［1］。三七成分復雜，主要藥用成分為人參皂苷［2］。現在常用來分析三七的方法有薄層色譜法（TLC）［3］、高效液相色譜法（HPLC）［4］、核磁共振-質譜聯用法（NMR-MS）［5］、超高效液相色譜法（UPLC）［6-7］等。

拉曼光譜（Raman spectra）是一種散射光譜，相對于常規分析方法，具有樣品前處理簡單、操作快速簡便、綠色環保等優點，近年來在食品［8-10］、生物［11-12］、醫藥［13-14］等分析領域發展迅速。表面增強拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）具有增強振動信號、低檢測限以及良好的吸附選擇性，因此在眾多領域的應用分析上具有良好的發展潛力［15-16］。中藥三七成分復雜，常規的拉曼光譜直接測試效果不佳，熒光干擾較強。本研究建立了利用便攜式拉曼光譜儀快速測試三七中有效成分信號的表面增強拉曼光譜分析法，從而實現對三七藥材的快速分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與測試條件

儀器：EZRamam-M便攜式拉曼光譜儀（EnWave Optronics公司）；Tecnai-12透射電子顯微鏡（飛利浦公司）；UV-2401PC紫外可見光分光光度計（日本島津公司）；BI-9000高濃度激光粒度分布儀（美國布魯克海文儀器公司）；SZCL-2數顯智能控溫磁力攪拌器（杭州瑞佳精密科學儀器有限公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；80-2離心沉淀器（金壇市醫療儀器廠）；電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

拉曼測試條件：光譜測量范圍0～3 000 cm-1，CCD檢測器，光譜分辨率1 cm-1，積分時間30 s，平均積分2次。采用785 nm半導體激光作為激發光源，激光功率為500 mW。

1.2 藥材與試劑

藥材：20頭三七，產于云南，購于鎮江市存仁堂大藥房（安徽亳州市藥材總公司，批號：20130618），經藥學院傅海珍老師鑒定為道地藥材。

試劑：硝酸銀（分析純，上海試劑一廠）；檸檬酸三鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工）；甲醇、硫酸、三氯甲烷、乙酸乙酯、羅丹明B（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水均為實驗室自制雙蒸水。

1.3 樣品處理

三七粉末：取原藥材，洗凈烘干（60℃）后切片，搗碎研磨，過200目篩即可。

三七水提樣品：稱取烘干后的三七藥材切片5 g，于燒杯中加水500 mL，浸泡30min，煎煮1 h后，兩層紗布過濾，取濾液。將濾液濃縮至100 mL后離心，取上清液于4℃冰箱內保存備用。

三七醇提樣品：取三七粉末5 g于具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL浸潤，超聲1 h后，靜置，取上清液于4℃冰箱內保存備用。

1.4 銀膠溶液的制備

參考Lee等［17］的方法，以檸檬酸三鈉還原硝酸銀制備銀納米粒子。將100 mL硝酸銀溶液（0.002 2 mol/L）于智能控溫磁力攪拌器上攪拌（1 000 r/ min）加熱到90℃，再逐滴加入2.6 mL檸檬酸三鈉溶液（0.039 mol/L），90℃恒溫攪拌1 h至溶液呈黃綠色。

1.5 拉曼掃描方法

三七粉末樣品：取少許三七粉末樣品于固體檢測架上，滴加適量銀膠溶液，待其成糊狀后刮平測試表面，進行拉曼掃描。

三七水提/醇提取液樣品：取1 mL三七提取液（水/醇提取）于透明樣品瓶中，滴加等體積的銀膠溶液，搖勻，10 min后進行拉曼掃描。

三七醇提樣品TLC-SERS掃描：以三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：水=15∶40∶22∶10下層溶液為展開劑，點樣5μL，平行點數樣。待展距約為10 cm時取出薄層板，晾干。在距板面垂直10 cm左右，噴以10%稀硫酸溶液，晾干，置烘箱中（105℃）烘干至出現紫紅色斑點后取出，于每個斑點處滴加1滴銀膠溶液，迅速利用刮刀搜集紫色斑點處的硅膠粉末，平行斑點合并為一種樣品，分別獲得樣品A、B、C。如圖1所示。

圖1 TLC-SERS采樣示意圖

1.6 數據處理

實驗獲得的拉曼光譜圖均采用OriginLab公司出品的Origin 8.5軟件繪制，使用FFT-Filter平滑處理方式，平滑點數為5。

2 結果與討論

2.1 銀溶膠的表征

由于中藥材三七以及其提取物成分復雜、活性成分含量低等原因，銀膠溶液的質量很可能對測試效果具有一定的影響，故本實驗對銀納米粒子的形態、大小、粒徑分布進行了初步表征，并以羅丹明B為探針分子，檢測了自制銀膠的增強效果及其最低作用濃度。

2.1.1 紫外吸收光譜 圖2為檸檬酸三鈉還原硝酸銀制備了表面增強基底材料銀溶膠的紫外吸收光譜圖，全波長掃描范圍為200～800 nm。

圖2 銀膠紫外吸收光譜

銀膠的紫外吸收光譜反映了納米粒子表面等離子體共振吸收的譜峰和強度，它們與納米粒子的形狀、濃度、粒徑分布以及粒徑大小有關。譜峰的最大吸收位置可用來粗略表征銀粒子的粒徑，譜峰的波長越大，相應的粒子半徑也越大；而譜峰的個數反映納米粒子的形狀，一般球形粒子只有1個吸收峰［18］。由圖2可知，在428 nm處有最大吸收，且為單峰，可初步判斷本實驗制備的銀納米粒子為類球形粒子。

2.1.2 透射電鏡及粒徑分布 將自制銀溶膠經預處理后于透射電子顯微鏡中檢視得到透射電鏡圖（圖3），可觀察到球形銀納米顆粒，粒徑在100 nm左右。圖4為銀納米粒子的粒徑分布圖，結果顯示本實驗自制銀膠納米粒子粒徑呈正態分布，平均粒徑為102.9 nm，分散性良好。

圖3 銀納米粒子電鏡圖

圖4 銀納米粒子粒徑分布圖

2.1.3 銀納米粒子的增強效果 以0.000 1 g/mL的羅丹明B為探針分子檢測銀膠溶液的增強效果，結果見圖5a，同一質量濃度的羅丹明B與不同存放時間的銀膠所獲得的SERS圖譜有明顯不同，新制銀膠與存放24 h后的銀膠相比峰信號較強，圖譜更豐富，而存放48 h后的銀溶膠幾乎不具有增敏作用，銀膠存放時間久可能有沉降和聚集，影響增敏效果，所以本實驗中增敏材料均采用新制銀膠；另外，0.000 1 g/mL羅丹明B的常規拉曼光譜如圖5a中的d光譜所示，未見明顯的拉曼信號，而滴加了新制銀膠的羅丹明B拉曼信號較好，峰譜信息豐富，特征峰明顯，由此證明，本實驗自制的銀膠具有良好的拉曼信號增敏作用。

為考察本實驗自制銀膠增敏效果的靈敏度，分別配制質量濃度為0.000 5，0.000 2，0.000 1，0.000 08、0.000 05和0.000 01 g/mL羅丹明B溶液，分別滴加等體積的新制銀膠后測試不同質量濃度羅丹明B的SERS，如圖5b。結果顯示，濃度低至0.000 05 g/mL的羅丹明B在增敏材料的作用下亦可出現較理想的拉曼信號，當濃度為0.000 01 g/mL時，即使在添加了增敏材料的情況下也未能觀察到有效的拉曼信號。由此可推測，在本實驗中所制備銀溶膠的作用下，可檢測到質量濃度為0.000 05 g/ mL的單一化學物質。

2.2 三七的SERS圖譜及解析

2.2.1 三七樣品的拉曼光譜 三七粉末樣品的常規拉曼以及SERS測試圖譜如圖6，三七粉末樣品直接測試其常規拉曼光譜得到一個“熒光包”，并未獲得拉曼信號，這可能與中藥材成分復雜、熒光強等因素有關；滴加了新制銀溶膠的三七粉末樣品，測試了其樣品的多個位置，驗證得出該圖譜穩定，特征峰位置固定，該圖譜可用作鑒別20頭云三七藥材的佐證。

圖6 三七粉末樣品的常規拉曼光譜及表面增強拉曼光譜

三七水提/醇提樣品與等體積的新制銀膠混合后測試其SERS，結果如圖7所示。結果表明，三七水提液的常規拉曼光譜圖為一“熒光包”，而加了等體積的銀溶膠后，在310，475，615，740，925，943，1 080，1 120，1 330 cm-1處出現了微弱的拉曼信號。三七醇提液的常規拉曼光譜在1 030，1 465 cm-1出現了2個明顯的拉曼信號，而該兩處的拉曼信號峰正好與甲醇的2個特征峰位置一致，實為C-H的面內振動以及C-O-H的彎曲振動引起的拉曼信號；滴加了等體積新制銀膠的三七醇提液樣品的SERS圖譜在735，943，1 030，1 080，1 330，1 385，1 465以及1 533 cm-1等處出現了微弱的拉曼信號，扣除溶劑峰后，735，943，1 080，1 330 cm-1等相同位置出現了拉曼信號，其中735，943，1 330 cm-1可能是三七中糖類碳水化合物的特征峰，而1 080 cm-1可能為人參皂苷分子母核六元環的C-C振動峰，水提液中925，1 120 cm-1為人參皂苷中C-O-C醚鍵的振動峰，310，475 cm-1等600 cm-1以下多為三七中有效成分的環骨架模型引起的振動［19］。

圖7 三七提取液的常規拉曼光譜以及表面增強拉曼光譜

2.2.2 三七醇提液的TLC-SERS檢測 由以上測試結果可知，三七粉末樣品滴加了自制銀膠后會出現拉曼信號，但由于成分太復雜、熒光較強等干擾因素的存在，三七粉末的SERS圖譜的信息并不豐富，嚴格意義上講只存在個別特征峰；而三七水提液和醇提液與銀膠混合后測試的SERS圖譜有相應拉曼信號出現，但是信號均較微弱，熒光影響依然存在。

為了進一步克服中藥復雜系統拉曼熒光強的弱點，得到三七中單一有效成分的詳細拉曼圖譜，本實驗采取了將經過甲醇粗提的三七樣品經TLC法進行簡單分離后，測試其單一組分的SERS。為排除硅膠存在對測定主成分的影響，本實驗中先測試硅膠G的SERS作為空白對照，結果如圖8所示，空白硅膠G的SERS并沒有明顯的拉曼信號，所以對樣品中主成分的拉曼光譜信號并無影響。

圖8 空白硅膠G的表面增強拉曼光譜

圖9為顯色斑點采集樣品A、B、C的SERS圖譜，結果顯示3種單一成分在471，543，960，1 015，1 113，1 233，1 374，1 475 cm-1附近均有拉曼峰出現，推測其為三七中人參皂苷母核及相同基團振動變形所引起的。如1 015 cm-1附近為伯醇C-C-O的面外伸縮振動，1 113 cm-1為仲醇C-C-O的面外伸縮振動，1 233 cm-1為環氧化合物的環對稱伸縮，1 374 cm-1為六元環的環伸縮，1 457 cm-1為六元環椅式異構體的剪式振動［20-21］。

但比較3個圖譜可發現，除了以上共有峰以外，每個成分的SERS還有其特征峰。如斑點A樣品的SERS圖譜中726，781 cm-1等特征峰，斑點B樣品的SERS圖譜中212，743，1 169 cm-1等特征峰，斑點C樣品的SERS圖譜中361 cm-1處出現的峰。根據這些特征峰的信息，我們可以用SERS來區分和鑒別三七提取物中不同的有效成分，建立三七中各種有效成分的標準對照拉曼圖譜，更便于實際鑒別操作中的成分鑒別，也為今后應用SERS定量分析中藥材中有效成分打下基礎。

圖9 三七TLC分離斑點的表面增強拉曼光譜

3 結論

本實驗建立了利用SERS技術快速、穩定、靈敏地分析測試三七藥材粉末、三七藥材提取物中成分的方法，以及經簡單預處理后，結合TLC分離方法，應用SERS來檢測分析三七中單一有效成分的方法。實驗結果表明，SERS法可快速獲得三七藥材粉末、三七提取物的特征拉曼光譜，在今后的實驗中可借鑒此法建立不同產地以及不同采收季節等三七的拉曼圖譜庫，進一步完善三七藥材拉曼光譜鑒定的方法。另外，可結合標準對照品，采用TLCSERS法，建立三七提取物中多個不同成分的標準SERS庫，直接作為各有效成分的參考對照。同時，本實驗中所建立的方法可拓展到其他中藥材的鑒定和分析中，為中藥快檢技術提供新的方法。

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Rapid analysis of active ingredients in Panax notoginseng using surface enhanced Raman spectroscopy

WEICheng-hua，CHEN Juan，XU Man-ling，QIXue-yong
（School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To establish surface-enhanced Raman spectroscopy（SERS）method for rapid analysis of active ingredients in Panax notoginseng.M ethods：Panax notoginseng was pretreated simply，then we tested the powder，water and alcohol extracts of Panax notoginseng by SERS respectively.We also got the spectrum of single active ingredient of the alcohol extracts combined with TLC，and analyzed these spectrum.Results：The powder，water and alcohol extracts of Panax notoginseng only could obtain weak signals of SERS directly，but the single active ingredient of Panax notoginseng separated by TLC technology could obtain its SERS spectra ideally.Conclusion：Themethod established in this article for rapid analysis of Panax notoginseng was efficient，rapid，specific，and high sensitivity，it can be extended to quality control and analysis in the identification of other herbalmedicines.

surface-enhanced Raman spectroscopy；Panax notoginseng；rapid analysis

R282.5 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0263-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150009

江蘇省高等學校大學生實踐創新訓練計劃項目（201410299029Z）

衛程華（1994—），女，本科生；戚雪勇（通訊作者），副教授，E-mail：qixyemail@163.com

2015-01-16 ［編輯］ 何承志