液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中克倫特羅手性對(duì)映體殘留量

陳國(guó)等

摘 要：建立測(cè)定豬肉中克倫特羅手性對(duì)映異構(gòu)體殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。5 g豬肉樣品在堿化的條件下用乙酸乙酯提取，提取后用稀鹽酸進(jìn)行反萃取，萃取液過SCX固相萃取小柱，最后用5%氨化甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL甲醇（含0.02%的乙酸和0.1%的乙酸銨）定容。采用Astec CHIROBIOTICTM V手性色譜柱，以甲醇∶冰乙酸∶乙酸銨=99.88∶0.02∶0.10（V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行液相分離，電噴霧正離子（ESI+）模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。克倫特羅單一對(duì)映體在2.0～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.997 0，豬肉樣品中克倫特羅最低檢測(cè)限和定量限分別為0.10 μg/kg和0.25 μg/kg。豬肉中克倫特羅手性對(duì)映體在0.25～0.75 μg/kg范圍內(nèi)的回收率為95.8%～102.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。

關(guān)鍵詞：克倫特羅；手性對(duì)映體；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；固相萃取

Determination of Residual Clenbuterol Enantiomers in Pork by Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry

CHEN Guo1， LIU Yongjun2， Lü Yan1， SUN Yami1， WU Yinliang1，*

（1. The Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China；

2. The Center for Animal Disease Control and Prevention of China， Beijing 100125， China ）

Abstract： A method was developed for determining residual clenbuterol enantiomers in pork by liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Five grams of samples were extracted with ethyl acetate under basic condition. Then， clenbuterol enantiomers were back-extracted from the extracts using diluted hydrochloric acid. The hydrochloric acid extract was purified by SCX solid phase extraction （SPE） cartridge. The eluent was dried by blowing nitrogen and the residue was dissolved in 500 μL of methanol with 0.02% acetic acid and 0.1% ammonium acetate. The analytes were analyzed by LC-MS/MS on a chiral column （Astec CHIOBIOTICTM V） with a mixture of methanol-acetic acid-ammonium acetate as the mobile phase and quantified by the internal standard calibration curve method. Good linearities were obtained for two enantiomers in the concentration range of 2.0 – 200 μg/L with a correlation coefficient more than 0.997 0. The recoveries for the two enantiomers in pork were 95.8% – 102.1% at the fortified levels of 0.25 – 0.75 μg/kg with relative standard deviations less than 5%. The limits of detection （LOD） and quantitation （LOQ）were 0.10 and 0.25 μg/kg， respectively.

Key words： clenbuterol； enantiomers； liquid chromatography with tandem mass spectrometry； solid phase extraction

中圖分類號(hào)：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2015）05-0022-05

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201505006

克倫特羅（clenbuterol）俗稱“瘦肉精”，曾常被非法應(yīng)用于畜牧業(yè)，用來提高酮體瘦肉率。然而，由于克倫特羅易在動(dòng)物組織中形成殘留，曾多次發(fā)生嚴(yán)重的人畜中毒事故。目前，我國(guó)和歐盟已禁止克倫特羅作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用。然而在評(píng)估克倫特羅對(duì)人體健康造成的危害時(shí)，往往對(duì)該藥物作為單一化合物來看待，未考慮其是手性藥物這一特征。而手性藥物不同異構(gòu)體之間在毒性、致畸、致癌、致突變上往往存在差異，必然導(dǎo)致對(duì)其危害估計(jì)不準(zhǔn)確。因此若要更加科學(xué)評(píng)估該藥物對(duì)人體健康造成的危害，首先應(yīng)建立該藥物在動(dòng)物組織中的對(duì)映體殘留分析方法。

由于包括克倫特羅在內(nèi)的β2-受體激動(dòng)劑類藥物對(duì)動(dòng)物性食品安全的影響較大，目前無論國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物性食品中β2-受體激動(dòng)劑類藥物殘留的分析方法較多，主要有酶聯(lián)免疫吸附法[1-3]、液相色譜法[4-7]、氣相色譜質(zhì)譜法（gas chromatography，GC）[8-11]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，

LC-MS/MS）法 [12-18]等；但對(duì)生物樣品中克倫特羅對(duì)映體水平上的分析方法研究多集中在生物體液，而對(duì)動(dòng)物組織中的對(duì)映體分析報(bào)道相對(duì)較少，且所采用的分析手段主要為氣相色譜法和液相色譜法。氧氟沙星的手性分離方法主要包括采用手性流動(dòng)相或衍生的方法以及采用手性色譜柱進(jìn)行分離[19-20]。本實(shí)驗(yàn)采用手性色譜柱實(shí)現(xiàn)了克倫特羅對(duì)映體的拆分，并在前期對(duì)動(dòng)物性食品中β2-受體激動(dòng)劑類藥物殘留分析方法研究的基礎(chǔ)上，建立提取、凈化效果較好，分離相對(duì)較快的豬肉中克倫特羅對(duì)映體殘留量分析方法，該方法的建立為進(jìn)一步研究克倫特羅在對(duì)映體水平上的毒性毒理、代謝等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空白豬肉樣品購(gòu)于寧波市江東區(qū)歐尚超市，實(shí)驗(yàn)用肉豬為健康肉豬，體質(zhì)量70 kg左右，用藥前測(cè)定是否含克倫特羅。

鹽酸克倫特羅（99%） 中國(guó)藥品生物制品檢定所；鹽酸克倫特羅-D9（100 μg/L） 德國(guó)

Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)默克公司；

甲酸（色譜純） 美國(guó)天地有限公司；強(qiáng)陽離子交換柱（SCX，500 mg/3 mL） 美國(guó)Supelco公司；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Waters公司；3K15離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取含100.0 mg克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，該儲(chǔ)備液含單一克倫特羅對(duì)映體質(zhì)量濃度為500 μg/mL。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

用流動(dòng)相稀釋克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制含單一對(duì)映體質(zhì)量濃度分別為2、10、20、50、100、200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，各工作液中含克倫特羅-D9單一對(duì)映異構(gòu)體質(zhì)量濃度均為25 μg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g豬肉樣品于帶蓋的50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入3 mL 10%碳酸鈉溶液，再加入20 mL乙酸乙酯，旋渦混合30 s， 5 000 r/min離心2 min，吸取上層溶液，再以15 mL乙酸乙酯同樣步驟提取1次，合并提取液；在收集的提取液中加入5 mL 0.20 mol/L的鹽酸溶液，旋渦混合30 s，5 000 r/min離心2 min，吸取下層溶液，同樣步驟重復(fù)萃取1 次，合并2 次萃取液。混勻萃取液后過已經(jīng)5 mL甲醇、5 mL水和5 mL 30 mmol/L鹽酸活化的SCX小柱，在溶劑流過固相萃取柱后，抽干SCX小柱，再用5 mL 4%氨化甲醇溶液洗脫，在50 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈缮鲜鱿疵撘海嚬芾鋮s后加入500 mL流動(dòng)相溶解，過0.22 μm濾膜后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.3.3 儀器條件

色譜柱Astec CHIROBIOTICTM V手性色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶乙酸∶乙酸胺=99.88∶0.02∶0.10（V/V），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量50 μL。ESI正離子電離模式；毛細(xì)管電壓3.9 kV；源溫110 ℃；去溶劑氣溫度350 ℃；克倫特羅監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為277>203、277>168和277>132；克倫特羅-D9監(jiān)測(cè)離子對(duì)286>204。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離條件的選擇和優(yōu)化

目前對(duì)于分離克倫特羅對(duì)映體，最有效的方式采用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素型手性色譜柱來進(jìn)行分離。本研究采用Astec CHIROBIOTICTM V手性色譜柱在甲醇-冰乙酸-乙酸銨體系內(nèi)對(duì)克倫特羅對(duì)映體進(jìn)行了拆分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫30 ℃時(shí)，同一乙酸濃度下，乙酸胺濃度增加時(shí)，分離度降低，分析時(shí)間縮短，靈敏度增高；同樣在同一乙酸銨濃度下，乙酸濃度增加時(shí)分離度降低，分析時(shí)間縮短，靈敏度增高。而通過已有的研究可知包括克倫特羅在內(nèi)的β2-受體激動(dòng)劑與大環(huán)內(nèi)酯類藥物手性固定相最重要的相互作用主要為氫鍵作用、π-π電子相互轉(zhuǎn)移、偶極誘導(dǎo)作用。而本實(shí)驗(yàn)主要是通過乙酸和乙酸胺濃度的變化影響氫鍵作用后導(dǎo)致兩對(duì)映體的洗脫速度發(fā)生變化最終造成出峰時(shí)間和分離度變化。為了在保證克倫特羅對(duì)映體分離的情況下盡可能獲得最大的靈敏度，因此本方法進(jìn)行殘留分析時(shí)最終選擇甲醇∶乙酸∶乙酸胺=

99.88∶0.02∶0.10（V/V）作為流動(dòng)相。在此條件下，先出峰的為（-）-對(duì)映體，后出峰的為（+）-對(duì)映體，兩對(duì)映體分離良好（圖1）。

a.克倫特羅-D9監(jiān)測(cè)離子對(duì)286>204；b、c、d.克倫特羅監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為277>203、277>168、277>132；e.總離子流色譜圖；1.（-）-克倫特羅-D9對(duì)映體；2.（+）-克倫特羅-D9對(duì)映體；3.（-）-克倫特羅對(duì)映體；4.（+）-克倫特羅對(duì)映體。

圖 1 克倫特羅對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

Fig.1 Typical chromatograms of clenbuterol enantiomers （50 ng/mL）

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

本方法提取凈化過程主要根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

NY/T 468—2006的前處理方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但由于該方法為GC-MS方法，當(dāng)儀器方法轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)C-MS/MS法時(shí)是否有雜質(zhì)影響，有待考察。于是在方法建立過程中，對(duì)是否有雜質(zhì)干擾和添加回收情況作了進(jìn)一步的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用LC-MS/MS分析時(shí)豬肉樣品中不存在雜質(zhì)峰的干擾（圖2）。

1.克倫特羅-D9監(jiān)測(cè)離子對(duì)286>204；2～4.克倫特羅監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為277>203、277>168、277>132；5.總離子流色譜圖；A.（-）-克倫特羅-D9對(duì)映體；B.（+）-克倫特羅-D9對(duì)映體；C.（-）-克倫特羅對(duì)映體；D.（+）-克倫特羅對(duì)映體。

圖 2 豬肉空白樣品（a）和豬肉添加樣品（b， 0.50 μg/kg）色譜圖

Fig.2 Chromatograms of clenbuterol enantiomers in blank pork （a） and pork fortified sample （b， 0.50 μg/kg）

2.3 線性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.1.2節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對(duì)克倫特羅2 種對(duì)映異構(gòu)體在2.0～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)以待測(cè)物定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)離子對(duì)峰面積比值對(duì)質(zhì)量濃度作圖，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=0.044 4x―0.073 4（（―）-克倫特羅對(duì)映體）和y=0.043 7x―0.066 9（（+）-克倫特羅對(duì)映體），相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.997 7和0.997 0，說明本方法適用于2 種克倫特羅對(duì)映體殘留量的定量分析。

2.4 回收率、精密度和檢出限

取空白豬肉樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成0.25、0.50、0.75 μg/kg的加標(biāo)樣品，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行操作，每個(gè)添加水平重復(fù)3 次。從表1可見，各添加量回收率在95.8%～103.1%之間。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.12%～2.64%，批間RSD為2.65%～3.02%，可見該方法能滿足現(xiàn)行藥物殘留分析的要求。本實(shí)驗(yàn)選擇0.25 μg/kg添加實(shí)驗(yàn)中響應(yīng)最低樣品的信噪比，并按RSN=3計(jì)算2 種克倫特羅對(duì)映體的檢出限，結(jié)果均為0.10 μg/kg；按RSN=10計(jì)算定量限，結(jié)果均為0.25 μg/kg。

表 1 豬肉中的克倫特羅對(duì)映體添加實(shí)驗(yàn)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 方法應(yīng)用

利用該方法進(jìn)行了克倫特羅外消旋體在豬體內(nèi)克倫特羅立體選擇性降解行為實(shí)驗(yàn)，停藥后7 d測(cè)定豬肉中克倫特羅2個(gè)對(duì)映體含量，發(fā)現(xiàn)（-）-克倫特羅對(duì)映體含量為1.45 μg/g，（+）-克倫特羅對(duì)映體含量為1.76 μg/g，可見克倫特羅外消旋體在豬體內(nèi)降解存在立體選擇性。

3 結(jié) 論

本研究建立了豬肉中克倫特羅對(duì)映體測(cè)定的LC-MS/MS方法。豬肉樣品在堿性條件下用乙酸乙酯提取，經(jīng)稀鹽酸反萃取后通過SCX固相萃取小柱凈化，凈化后的樣品利用手性色譜柱進(jìn)行分離，進(jìn)行LC-MS/MS法測(cè)定。該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，利用該方法可為進(jìn)一步開展克倫特羅在對(duì)映體水平上的毒性毒理、代謝等提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王選年， 楊艷艷， 李青梅， 等. 鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備及其特性[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2002， 31（6）： 30-33.

[2] 王選年， 楊艷艷， 邢廣旭， 等. 鹽酸克倫特羅單克快速檢測(cè)試劑盒的研制[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2004， 24（1）： 75-78.

[3] SHEU S Y， LEI Y C， TAI Y T， et al. Screening of salbutamol residues in swine meat and animal feed by an enzyme immunoassay in Taiwan[J]. Analytica Chimica Acta， 2009， 654： 148-153.

[4] RASHID B A， KWASOWSKI P， STEVENSON D. Solid phase extraction of clenbuterol from plasma using immunoaffinity followed by HPLC[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 1999， 21： 635-639.

[5] LAWRENCE J F， M?NARD C. Determination of clenbuterol in beef liver and muscle tissue using immunoaffinity chromatograhic cleanup and liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection[J]. Journal of Chromatography B， 1997， 696： 291-297.

[6] ARESTA A， PALMISANO C F， ZAMBONIN C G. Determination of clenbuterol in human urine and serum by solid-phase microectraction coupled to liquid chromatography[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2008， 47： 641-645.

[7] POSYNIAK A， ZMUDZKI J， NIEDZIELSKA J. Screening procedures for clenbuterol residue determination in bovine urine and liver matrices using enzyme-linked immunosorbent assay and liquid chromatography[J]. Analytica Chimica Acta， 2003， 483： 61-67.

[8] 吳銀良， 李曉薇， 劉素英， 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定肝臟組織中鹽酸克倫特羅和鹽酸萊克多巴胺[J]. 分析化學(xué)， 2006， 34（8）： 1083-1086.

[9] 孫澤祥， 鮑偉華， 楊挺， 等. 克倫特羅在豬尿液和血液中殘留消除相關(guān)性研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2010， 37（8）： 160-163.

[10] WANG L， LI Y Q， ZHOU Y K， et al. Determination of four β2-agonists in meat， liver and kidney by GC-MS with dual internal standards[J]. Chromatographia， 2010， 71： 737-739.

[11] GONZ?LEZ P， FENTE C A， FRANCO C， et al. Determination of residues of the β-agonist clenbuterol in liver of medicated farm animals by gas chromatography-mass spectrometry using diphasic dialysis as an extraction procedure[J]. Journal of Chromatography B， 1997， 693： 321-326.

[12] NIELEN M W F， LASAROMS J J P， ESSERS M L， et al. Multiresidue analysis of beta-agonists in bovine and porcine urine， feed and hair using liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry[J]. Analytical Bioanalytical Chemistry， 2008， 391： 199-210.

[13] BLANCA J， MUNOZ P， MORGADO M， et al. Determination of clenbuterol， ractopamine and zilpaterol in liver and urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta， 2005， 529： 199-205.

[14] ZHENG H， DENG L G， LU X， et al. UPLC-ESI-MS-MS determination of three β2-agonists in pork[J]. Chromatographia， 2010， 72： 79-84.

[15] DU X D， WU Y L， YANG H J， et al. Simultaneous determination of 10 β2-agonists in swine urine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and multi-walled carbon nanotubes as a reversed dispersive solid phase extraction sorbent[J]. Journal of Chromatography A， 2012， 1260： 25-32.

[16] SHISHANI E， CHAI S C， JAMOKHA S， et al. Determination of ractopamine in animal tissues by liquid chromatography-fluorescence and liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta， 2003， 483： 137-145.

[17] WILLIAMS L D， CHURCHWELL M I， DOERGE D R. Multiresidue confirmation of β-agonists in bovine retina and liver using LC-ES/MS/MS[J]. Journal of Chromatography B， 2004， 813： 35-45.

[18] THEVIS M， SCHEBALKIN T， THOMAS A， et al. Quantification of clenbuterol in human plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chromatographia， 2005， 62： 435-439.

[19] 吳銀良， 楊挺， 單吉浩， 等. 高效液相色譜法測(cè)定豬尿中克倫特羅對(duì)映異構(gòu)體殘留量[J]. 分析化學(xué)， 2010， 38（6）： 833-837.

[20] SMITH D J. Stereochemical composition of clenbuterol residues in edible tissues of swine[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2000， 48（12）： 6036-6043.