液相色譜串聯質譜法測定豬肉中克倫特羅手性對映體殘留量

陳國等

摘 要：建立測定豬肉中克倫特羅手性對映異構體殘留量的液相色譜串聯質譜分析方法。5 g豬肉樣品在堿化的條件下用乙酸乙酯提取，提取后用稀鹽酸進行反萃取，萃取液過SCX固相萃取小柱，最后用5%氨化甲醇洗脫，洗脫液經氮氣吹干后用500 μL甲醇（含0.02%的乙酸和0.1%的乙酸銨）定容。采用Astec CHIROBIOTICTM V手性色譜柱，以甲醇∶冰乙酸∶乙酸銨=99.88∶0.02∶0.10（V/V）為流動相進行液相分離，電噴霧正離子（ESI+）模式電離，多反應監測（MRM）模式檢測，內標法定量。克倫特羅單一對映體在2.0～200 μg/L質量濃度范圍內呈良好的線性，線性相關系數均大于0.997 0，豬肉樣品中克倫特羅最低檢測限和定量限分別為0.10 μg/kg和0.25 μg/kg。豬肉中克倫特羅手性對映體在0.25～0.75 μg/kg范圍內的回收率為95.8%～102.1%之間，相對標準偏差均小于5%。

關鍵詞：克倫特羅；手性對映體；液相色譜串聯質譜法；固相萃取

Determination of Residual Clenbuterol Enantiomers in Pork by Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry

CHEN Guo1， LIU Yongjun2， Lü Yan1， SUN Yami1， WU Yinliang1，*

（1. The Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China；

2. The Center for Animal Disease Control and Prevention of China， Beijing 100125， China ）

Abstract： A method was developed for determining residual clenbuterol enantiomers in pork by liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Five grams of samples were extracted with ethyl acetate under basic condition. Then， clenbuterol enantiomers were back-extracted from the extracts using diluted hydrochloric acid. The hydrochloric acid extract was purified by SCX solid phase extraction （SPE） cartridge. The eluent was dried by blowing nitrogen and the residue was dissolved in 500 μL of methanol with 0.02% acetic acid and 0.1% ammonium acetate. The analytes were analyzed by LC-MS/MS on a chiral column （Astec CHIOBIOTICTM V） with a mixture of methanol-acetic acid-ammonium acetate as the mobile phase and quantified by the internal standard calibration curve method. Good linearities were obtained for two enantiomers in the concentration range of 2.0 – 200 μg/L with a correlation coefficient more than 0.997 0. The recoveries for the two enantiomers in pork were 95.8% – 102.1% at the fortified levels of 0.25 – 0.75 μg/kg with relative standard deviations less than 5%. The limits of detection （LOD） and quantitation （LOQ）were 0.10 and 0.25 μg/kg， respectively.

Key words： clenbuterol； enantiomers； liquid chromatography with tandem mass spectrometry； solid phase extraction

中圖分類號：TS251.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）05-0022-05

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201505006

克倫特羅（clenbuterol）俗稱“瘦肉精”，曾常被非法應用于畜牧業，用來提高酮體瘦肉率。然而，由于克倫特羅易在動物組織中形成殘留，曾多次發生嚴重的人畜中毒事故。目前，我國和歐盟已禁止克倫特羅作為生長促進劑使用。然而在評估克倫特羅對人體健康造成的危害時，往往對該藥物作為單一化合物來看待，未考慮其是手性藥物這一特征。而手性藥物不同異構體之間在毒性、致畸、致癌、致突變上往往存在差異，必然導致對其危害估計不準確。因此若要更加科學評估該藥物對人體健康造成的危害，首先應建立該藥物在動物組織中的對映體殘留分析方法。

由于包括克倫特羅在內的β2-受體激動劑類藥物對動物性食品安全的影響較大，目前無論國內外對動物性食品中β2-受體激動劑類藥物殘留的分析方法較多，主要有酶聯免疫吸附法[1-3]、液相色譜法[4-7]、氣相色譜質譜法（gas chromatography，GC）[8-11]和液相色譜串聯質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，

LC-MS/MS）法 [12-18]等；但對生物樣品中克倫特羅對映體水平上的分析方法研究多集中在生物體液，而對動物組織中的對映體分析報道相對較少，且所采用的分析手段主要為氣相色譜法和液相色譜法。氧氟沙星的手性分離方法主要包括采用手性流動相或衍生的方法以及采用手性色譜柱進行分離[19-20]。本實驗采用手性色譜柱實現了克倫特羅對映體的拆分，并在前期對動物性食品中β2-受體激動劑類藥物殘留分析方法研究的基礎上，建立提取、凈化效果較好，分離相對較快的豬肉中克倫特羅對映體殘留量分析方法，該方法的建立為進一步研究克倫特羅在對映體水平上的毒性毒理、代謝等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空白豬肉樣品購于寧波市江東區歐尚超市，實驗用肉豬為健康肉豬，體質量70 kg左右，用藥前測定是否含克倫特羅。

鹽酸克倫特羅（99%） 中國藥品生物制品檢定所；鹽酸克倫特羅-D9（100 μg/L） 德國

Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純） 美國默克公司；

甲酸（色譜純） 美國天地有限公司；強陽離子交換柱（SCX，500 mg/3 mL） 美國Supelco公司；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

液相色譜串聯質譜聯用儀 美國Waters公司；3K15離心機 美國Sigma公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

1.3.1.1 標準儲備液

準確稱取含100.0 mg克倫特羅的標準品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得克倫特羅標準儲備液，該儲備液含單一克倫特羅對映體質量濃度為500 μg/mL。

1.3.1.2 標準工作液

用流動相稀釋克倫特羅標準儲備液配制含單一對映體質量濃度分別為2、10、20、50、100、200 μg/L的標準工作液，各工作液中含克倫特羅-D9單一對映異構體質量濃度均為25 μg/L，現配現用。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取5.0 g豬肉樣品于帶蓋的50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入3 mL 10%碳酸鈉溶液，再加入20 mL乙酸乙酯，旋渦混合30 s， 5 000 r/min離心2 min，吸取上層溶液，再以15 mL乙酸乙酯同樣步驟提取1次，合并提取液；在收集的提取液中加入5 mL 0.20 mol/L的鹽酸溶液，旋渦混合30 s，5 000 r/min離心2 min，吸取下層溶液，同樣步驟重復萃取1 次，合并2 次萃取液。混勻萃取液后過已經5 mL甲醇、5 mL水和5 mL 30 mmol/L鹽酸活化的SCX小柱，在溶劑流過固相萃取柱后，抽干SCX小柱，再用5 mL 4%氨化甲醇溶液洗脫，在50 ℃水浴中用氮氣吹干上述洗脫液，待試管冷卻后加入500 mL流動相溶解，過0.22 μm濾膜后進行LC-MS/MS分析。

1.3.3 儀器條件

色譜柱Astec CHIROBIOTICTM V手性色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：甲醇∶乙酸∶乙酸胺=99.88∶0.02∶0.10（V/V），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃；進樣量50 μL。ESI正離子電離模式；毛細管電壓3.9 kV；源溫110 ℃；去溶劑氣溫度350 ℃；克倫特羅監測離子對分別為277>203、277>168和277>132；克倫特羅-D9監測離子對286>204。

2 結果與分析

2.1 分離條件的選擇和優化

目前對于分離克倫特羅對映體，最有效的方式采用大環內酯類抗生素型手性色譜柱來進行分離。本研究采用Astec CHIROBIOTICTM V手性色譜柱在甲醇-冰乙酸-乙酸銨體系內對克倫特羅對映體進行了拆分，結果發現當柱溫30 ℃時，同一乙酸濃度下，乙酸胺濃度增加時，分離度降低，分析時間縮短，靈敏度增高；同樣在同一乙酸銨濃度下，乙酸濃度增加時分離度降低，分析時間縮短，靈敏度增高。而通過已有的研究可知包括克倫特羅在內的β2-受體激動劑與大環內酯類藥物手性固定相最重要的相互作用主要為氫鍵作用、π-π電子相互轉移、偶極誘導作用。而本實驗主要是通過乙酸和乙酸胺濃度的變化影響氫鍵作用后導致兩對映體的洗脫速度發生變化最終造成出峰時間和分離度變化。為了在保證克倫特羅對映體分離的情況下盡可能獲得最大的靈敏度，因此本方法進行殘留分析時最終選擇甲醇∶乙酸∶乙酸胺=

99.88∶0.02∶0.10（V/V）作為流動相。在此條件下，先出峰的為（-）-對映體，后出峰的為（+）-對映體，兩對映體分離良好（圖1）。

a.克倫特羅-D9監測離子對286>204；b、c、d.克倫特羅監測離子對分別為277>203、277>168、277>132；e.總離子流色譜圖；1.（-）-克倫特羅-D9對映體；2.（+）-克倫特羅-D9對映體；3.（-）-克倫特羅對映體；4.（+）-克倫特羅對映體。

圖 1 克倫特羅對映體標準溶液（50 ng/mL）多反應監測色譜圖

Fig.1 Typical chromatograms of clenbuterol enantiomers （50 ng/mL）

2.2 前處理條件的選擇

本方法提取凈化過程主要根據農業行業標準

NY/T 468—2006的前處理方法進行實驗，但由于該方法為GC-MS方法，當儀器方法轉換為LC-MS/MS法時是否有雜質影響，有待考察。于是在方法建立過程中，對是否有雜質干擾和添加回收情況作了進一步的研究。結果發現，當采用LC-MS/MS分析時豬肉樣品中不存在雜質峰的干擾（圖2）。

1.克倫特羅-D9監測離子對286>204；2～4.克倫特羅監測離子對分別為277>203、277>168、277>132；5.總離子流色譜圖；A.（-）-克倫特羅-D9對映體；B.（+）-克倫特羅-D9對映體；C.（-）-克倫特羅對映體；D.（+）-克倫特羅對映體。

圖 2 豬肉空白樣品（a）和豬肉添加樣品（b， 0.50 μg/kg）色譜圖

Fig.2 Chromatograms of clenbuterol enantiomers in blank pork （a） and pork fortified sample （b， 0.50 μg/kg）

2.3 線性實驗

根據1.3.1.2節配制標準工作溶液，對克倫特羅2 種對映異構體在2.0～200 μg/L質量濃度范圍內以待測物定量離子對與內標離子對峰面積比值對質量濃度作圖，所得標準曲線方程分別為y=0.044 4x―0.073 4（（―）-克倫特羅對映體）和y=0.043 7x―0.066 9（（+）-克倫特羅對映體），相關系數（R2）分別為0.997 7和0.997 0，說明本方法適用于2 種克倫特羅對映體殘留量的定量分析。

2.4 回收率、精密度和檢出限

取空白豬肉樣品，加入標準工作溶液配制成0.25、0.50、0.75 μg/kg的加標樣品，按照1.3.2節進行操作，每個添加水平重復3 次。從表1可見，各添加量回收率在95.8%～103.1%之間。批內相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.12%～2.64%，批間RSD為2.65%～3.02%，可見該方法能滿足現行藥物殘留分析的要求。本實驗選擇0.25 μg/kg添加實驗中響應最低樣品的信噪比，并按RSN=3計算2 種克倫特羅對映體的檢出限，結果均為0.10 μg/kg；按RSN=10計算定量限，結果均為0.25 μg/kg。

表 1 豬肉中的克倫特羅對映體添加實驗回收率和相對標準偏差

2.5 方法應用

利用該方法進行了克倫特羅外消旋體在豬體內克倫特羅立體選擇性降解行為實驗，停藥后7 d測定豬肉中克倫特羅2個對映體含量，發現（-）-克倫特羅對映體含量為1.45 μg/g，（+）-克倫特羅對映體含量為1.76 μg/g，可見克倫特羅外消旋體在豬體內降解存在立體選擇性。

3 結 論

本研究建立了豬肉中克倫特羅對映體測定的LC-MS/MS方法。豬肉樣品在堿性條件下用乙酸乙酯提取，經稀鹽酸反萃取后通過SCX固相萃取小柱凈化，凈化后的樣品利用手性色譜柱進行分離，進行LC-MS/MS法測定。該方法具有快速、靈敏、準確的特點，利用該方法可為進一步開展克倫特羅在對映體水平上的毒性毒理、代謝等提供參考。

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