不同葡萄糖濃度對霉菌產油能力的影響

梁 峰 王 莉，2 夏保密 宋兆齊，2 張淑紅，2 劉秀花，2

（1.商丘師范學院 生物精煉河南省工程實驗室，河南 商丘 476000；2.商丘師范學院 生命科學學院，河南 商丘 476000）

微生物油脂（microbial oils）又稱單細胞油脂（single cell oil，SCO），是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物合成的一類物質。微生物油脂主要是由不飽和脂肪酸（PUFAs）組成的甘油三酯（TAG），在脂肪酸組成上與植物油（如菜籽油、棕櫚油、大豆油等）相似。如果油脂積累量超過細胞總量的20%，即稱為產油微生物［1］。微生物油脂的研究和開發，不僅豐富了傳統的油脂工業技術，而且是工業化生產油脂的一個重要途徑［2］。

目前，能夠被用來生產油脂的微生物種類有酵母菌、霉菌、細菌和藻類等，其中以霉菌和藻類的真核生物居多。霉菌中脂肪酸類型要比酵母菌豐富，并含有豐富的γ-亞麻酸、花生四烯酸等多種不飽和脂肪酸［3］。同時，霉菌可以利用秸稈、食品工業廢棄物等纖維素物質，分解產生單糖，并以此作為合成油脂的原料。在人口快速增長的情況下，研究并優化霉菌的產油條件，確定最經濟高效的葡萄糖培養濃度，對于開辟新油源—微生物油脂具有重要的理論和實際意義［4］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的常現青霉P1（Penicillium flavidorsum）、土壤青霉P3（Penicillium terrestre）、綠色木霉L1（Trichoderma viride）、紅色脈孢霉H1（Neurosporspp）均由本實驗室收集保藏。

1.2 培養基

GMY 培養基［5］：磷酸二氫鉀8g，硫酸鎂0.5g，酵母提取 物3g，葡 萄 糖40g，水1L 調 至PH，5.5。GMY40、GMY60、GMY80、GMY100、GMY120（每升GMY 發酵液中葡萄糖的含量分別為40g、60g、80g、100g、120g），則發酵液中葡萄糖濃度分別為：4%、6%、8%、10%、12%。在115℃條件下高壓蒸汽滅菌30min。

1.3 發酵條件

吸取1ml 無菌水，分別注入斜面培養的四株霉菌試管中，吹打，晃動試管；將孢子液吸到1.5ml 的離心管中，反復吹打，使孢子充分分散；用血球計數板進行孢子計數，若孢子濃度過高，則需要倍比稀釋，最終保證每100ml發酵液的接種量為108個孢子［6］。在無菌條件下，分別接種P1、P3、L1、H1的孢子懸液于GMY40、GMY80、GMY120的發酵液中，在30℃、225r/min的條件下搖床培養3天，每隔24h進行定性定量檢測，跟蹤觀察4天。

1.4 油脂滴染色與顯微觀察

采用蘇丹黑染色方法進行染色，并通過顯微鏡拍照獲得霉菌在不同培養時間積累油脂滴的狀況［7］。

1.5 生物量的測定

每隔24h，利用真空水循環式抽濾泵，過濾收集菌絲體，再用真空凍干機凍干［8］。恒重后，得到菌體和稱量瓶的總重m2；在收集菌體前，先恒重稱量瓶，計為m1。那么，菌體的生物量M=m2-m1。

1.6 發酵液中殘糖量的測定

在接種前，先用阿貝折射儀檢測發酵液中初始糖含量，計為W1。在培養至1d、2d、3d、4d 時，分別吸取發酵液，利用阿貝折射儀檢測發酵液中殘余糖含量，計為W2。那么，消耗的葡萄糖量為：mG（消耗糖量）=W1-W2；葡萄糖轉化為生物量的效率（%）=mb（生物量）/mG（消耗糖量）×100%［9］。

1.7 油脂含量的測定

油脂能溶于有機溶劑如乙醚、石油醚等，且有機溶劑具有易揮發性。索氏抽提器可以進行回流蒸發和蒸餾，反復抽提樣品中的油脂［10］。菌體烘干，研磨粉碎后取一定重量的干菌體粉末用濾紙包好，放入索氏抽提器的提取管中，以30～60℃沸程的乙醚為抽提劑，取下抽提瓶，在80℃水浴中揮發掉殘留石油醚，再置于95～105℃烘箱中烘干，準確稱量粗油脂重量（m）［11-13］。

油脂含量（%）=m（油脂量）/M（生物量）×100%。

2 結果與討論

2.1 霉菌在不同葡萄糖濃度下產油能力比較

培養3d，收獲菌體，烘干后，利用索氏抽提法提取油脂，計算油脂產量（g/L）變化見表1。隨著葡萄糖濃度的升高，四株霉菌的油脂產量逐漸減小，在4%的糖濃度下積累的油脂量最多。其中，L1的油脂產量最大。

表1 四株霉菌的油脂產量（g/L）及細胞油脂含量（%）

表1所示四株霉菌的油脂含量M（%）變化，可知，L1、P1、P3菌株在葡萄糖濃度為4%的發酵液中，油脂含量較高；H1 菌株在葡萄糖濃度為8%的發酵液中，油脂含量較高。L1 菌株油脂含量卻最高，說明L1 合成油脂的能力最大。L1 和P1 菌體積累的油脂量與生物量呈正比，隨著糖濃度的升高，生物量逐漸降低，油脂量也逐漸降低；P3 在4%的濃度下菌體合成油脂的能力最大；H1 在8%的糖濃度下積累的生物量較少，但合成油脂的能力卻相對較大，與相關報道一致［14］。

圖1 四株霉菌利用葡萄糖轉化為油脂的效率

如圖1 所示不同霉菌葡萄糖-油脂的轉化率（%）差異。隨著葡萄糖濃度的升高，四株霉菌的葡萄糖-油脂轉化率均呈現降低趨勢；在葡萄糖濃度為4%的發酵液中，L1菌株的葡萄糖-油脂轉化率最高。隨著葡萄糖濃度升高，霉菌轉化糖的能力卻下降，消耗的糖并沒有轉化為更多的油脂和生物量，而是被呼吸作用消耗掉。

2.2 菌株L1產油條件優化

2.2.1 L1在不同糖濃度下積累生物量的能力。為了確定最經濟高效的葡萄糖濃度，使霉菌具有最佳的油脂合成能力，在葡萄糖濃度分別為4%、6%、8%、10%、12%的發酵液中，培養L1，進行形態學觀察和定性定量檢測。在1d、2d、3d、4d 時，分別收獲菌體，干燥后恒重，測定生物量（g），如圖2所示。

圖2 L1在不同葡萄糖濃度條件下的生物量

從圖4 可知，在葡萄糖濃度為4%的發酵條件下，L1菌體的生物量較大；在12%的糖濃度下，L1 的生物量最小；隨著發酵時間的延長，菌體的生物量逐漸增加；在4d時，L1積累的生物量達到最大值。

2.2.2 菌體L1 在不同糖濃度條件下葡萄糖消耗差異。分別在1d、2d、3d、4d 時，吸取發酵液，測得殘糖量，并計算L1在不同糖濃度下消耗的葡萄糖量，如圖3所示。

圖3 L1在不同糖濃度下消耗的葡萄糖量

由圖3可知，隨著發酵液中糖濃度的增加、培養時間的延長，L1 消耗的葡萄糖量也在增加。在4d 時，消耗糖最多，且L1在含糖量為8%、10%、12%的發酵液中消耗的糖量幾乎持平。

圖4 L1利用葡萄糖轉化為生物量的效率

從圖4可知，隨著發酵液中葡萄糖濃度的增加，L1對葡萄糖-生物量的轉化率逐漸減小。在葡萄糖濃度為4%時，L1 利用葡萄糖轉化為生物量的效率最大。在3d 以后，糖濃度10%、12%的發酵液中，L1 對糖的轉化率幾乎持平。糖含量越高，L1消耗的葡萄糖量越多，積累的生物量卻減少，說明L1只能利用一部分葡萄糖積累生物量。

2.2.3 不同糖濃度L1脂肪積累的差異。分別在培養1d、2d、3d、4d時，獲得干菌體，利用索氏抽提法，得到L1在不同葡糖糖濃度條件下的油脂產量（g/L），如表2所示。

表2 L1的油脂產量（g/L）和細胞含油量

由表2可知，隨著葡萄糖濃度的增加，L1菌體的油脂產量逐漸降低；隨著培養時間的延長，油脂產量逐漸增加。在4d時，L1在葡萄糖濃度為4%的發酵條件下，具有最高的油脂產量。在3d 以后，L1 在糖濃度為6%、8%、10%的條件下油脂產量幾乎持平，油脂積累已經達到最大值。在12%的糖濃度下，L1 的油脂產量在3d 最大，而在4d有所下降，油脂被分解消耗掉。隨著培養時間的延長，油脂含量先升高后降低，在3d 時達到最大值，為38.62%。L1的油脂產量與生物量呈正比，隨葡萄糖濃度的升高而降低，在高濃度的葡萄糖條件下油脂含量反而不高。

圖5 L1利用葡萄糖轉化為油脂的效率

由圖5可知，隨著葡萄糖濃度的升高，L1菌株利用葡萄糖轉化為油脂的效率逐漸降低。在葡糖糖濃度為4%的發酵條件下，L1消耗較少的葡萄糖卻產生較多的油脂，轉化率最大。葡萄糖濃度越高，轉化為油脂的效率卻越低，說明高濃度的葡萄糖會抑制油脂的合成，大量的葡萄糖通過呼吸作用而消耗。

2.2.4 菌體L1 的細胞內油脂滴連續變化。葡萄糖濃度為4%、6%、8%、10%、12%發酵條件下，分別在1d、2d、3d、4d時，對L1的菌絲體進行蘇丹黑染色。鏡檢結果如圖6 所示。由圖6 可知，在相同的發酵時間，葡萄糖濃度越高，L1菌體積累的油脂滴密度越低，含量越少。隨著培養時間的延長，L1積累的油脂逐漸增多，在4d時，油脂滴變大數目變小。在4%的糖濃度條件下，油脂滴密度較大，含量較多。說明高濃度的葡萄糖反而不利于油脂的積累，甚至會抑油脂的合成能力。

圖6 L1在不同葡萄糖濃度下的油脂滴染色結果

3 結語

本研究應用細胞形態學和細胞化學染色方法對霉菌進行跟蹤觀察，探究不同葡萄糖濃度的發酵條件對霉菌產油能力的影響。綜上所述，葡萄糖濃度會明顯影響霉菌的生物量、油脂積累量和葡萄糖轉化率。隨著葡萄糖濃度的升高，霉菌消耗的葡萄糖量逐漸增大，而霉菌的生物量并不一定增加；葡萄糖濃度越高，利用葡萄糖增加生物量和產生油脂的能力受到限制，大量的葡萄糖通過呼吸作用而被消耗，造成資源和能源的浪費。當培養基初始葡萄糖濃度過高，會出現明顯的抑制作用，這可能是由于培養基的滲透壓力隨濃度的升高而增加，而到后期葡萄糖被消耗，滲透壓的劇烈改變使菌體細胞不能耐受，導致菌體不能正常生長，繼而影響代謝水平，造成發酵周期延長、產率降低。葡萄糖濃度過高會導致菌體自身的代謝非常旺盛，細胞內產生大量的有機酸，影響到微環境的pH，葡萄糖的代謝產物也會抑制其他產物的合成。

通過對不同葡萄糖濃度條件下，四株霉菌的生長狀況和產油情況進行定性、定量分析，可以得出以下結論：四株霉菌中，L1的產脂能力最高；L1在葡萄糖濃度為4%的發酵條件下，油脂產量最佳為2.598g/L，油脂含量為38.62%，具有最大的油脂合成能力，且較低濃度時油脂積累較好，預示工業發酵可采用流加的工藝，下一步將就此開展研究。然而，本研究發酵底物為葡萄糖，當底物替換為其他糖（如木糖）或者混合糖時產油能力如何？這個問題將在后續研究中繼續探討。

［1］顏治，陳晶.微生物油脂及其開發利用研究進展［J］.油脂工程，2003（7）：13-15.

［2］ Somashekar D，Venkateshwaran G，Sambaiah K，et al.Effect of culture conditions on lipid and gamma- linolenic acid production by mucoraceous fungi［J］.Process Biochemistry，2002（38）：1719-1724.

［3］王禎小旭.微生物油脂生產與利用［J］.糧食與油脂，2005（10）：13-17.

［4］錢存柔，黃儀秀.微生物學實驗教程［M］.北京：北京大學出版社，2008.

［5］Colin Ratledge.Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for Single Cell Oil production［J］.Biochimie，2004（86）：807-815.

［6］ Sorger D，Daum G.Triacylglycerol biosynthesis in yeast［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2003（61）：289-299.

［7］李植峰，張玲，沈曉京，等.四種真菌油脂提取方法的比較［J］.微生物學報，2009，28（6）：72-75.

［8］Ratledge C，Wynn J.The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms［J］.Adr Appl Microbiol，2002，51：1-51.

［9］劉波，孫艷，劉永紅，等.產油微生物油脂生物合成與代謝調控研究進展［J］.微生物學報，2005，45（1）:153-156.

［10］Ratledge C.Regulation of lipid accumulation in oleaginous microorganisms［J］.Biochem Soc Trans，2002（30）：1047-1050.

［11］ Rattry J B M.Biotechnology and the fats and oils industry-An overview［J］.J Am Oil chem.Aoc，2004（61）：1701-1712.

［12］墨玉欣，劉宏娟.微生物發酵制備油脂的研究［J］.可再生能源，2006（6）：24-32.

［13］ Teixeira P，Castro H，Kirby R.Evidence of membrane lipid oxidation of spraydried Lactobaciclus bulgarrcus during storage［J］.Letters in Applied Microbiology，2006，22（1）：34-38.

［14］馬麗娟，邢大輝，王紅蕾，等.培養條件對產油微生物生長的影響［J］.生物工程學報，2009（1）：55-59.