苓桂術甘湯含藥血清對TGF-β1 誘導的大鼠心肌細胞H9c2 中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的影響*

許 閃，黃金玲，2，王 靚，2△，施 慧，卲 菁，2，洪星輝，甘賢兵，2，劉 蕾

（1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥230038；2.安徽省中醫藥科學院中西醫結合研究所，安徽 合肥230038）

慢性心力衰竭（CHF）是一種復雜的臨床癥狀，是各種心臟病的嚴重階段。目前研究證實，心室重構、內分泌及細胞因子的紊亂是CHF 病理生理過程發生發展的兩大因素[1]。在初始的心肌損傷以后，多種內源性的神經內分泌和細胞因子系統的激活，進一步加重了心肌損傷和心功能惡化[2]。機體可產生多種細胞因子，心肌細胞也成為多種細胞因子作用的靶細胞。炎性細胞因子在慢性心力衰竭中發揮著重要的作用[3-4]。

課題組前期研究證明，體內實驗中LGZGD 可以降低急性心肌梗死心室重構模型大鼠血清中TNF-α、IL-6 和ET-1 的含量，通過調節細胞因子網絡干預急性心肌梗死后的心室重構[5]；體外實驗中LGZGD 含藥血清可以通過增加細胞存活率來保護由TGF-β1誘導的H9c2 細胞損傷，通過改善細胞凋亡形態、降低細胞凋亡率、降低心肌細胞H9c2 中胱天蛋白酶3 和胱天蛋白酶8 的含量來抑制TGF-β1誘導的大鼠心肌細胞H9c2 的凋亡。實驗在前期研究基礎上，體外培養大鼠心肌細胞H9c2 并通過TGF-β1的誘導來建立心肌細胞H9c2 損傷模型，通過ELISA 法測定TNF-α、IL-6 和IL-1β 等含量的變化來觀察LGZGD 含藥血清對TGF-β1誘導的心肌細胞H9c2 損傷的影響，為CHF 的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞株

清潔級SD 大鼠，雄性（♂），體質量（200 ± 20）g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（皖）2011-002；自由攝食和飲水，室溫控制在20 ～25 ℃，相對濕度40%～60%，定時通風換氣。大鼠心肌細胞株H9c2 購于中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心。

1.2 藥品與試劑

LGZGD 按原方比例（茯苓∶桂枝∶白術∶甘草=4∶3∶3∶2）參考文獻[6]方法，由安徽省亳州市興和藥業有限公司提取制成含4.8 g 生藥/g 的干浸膏粉末（批號：20141223），其中桂皮醛含量9.945 mg·g-1，甘草酸含量：14.71 mg·g-1，密封4 ℃冰箱保存備用。

高糖DMEM 培養基（美國Gibco 公司），胎牛血清（美國Gibco 公司），胰蛋白酶（美國Sigma 公司），人重組TGF-β1（批號0913209，美國PEPROTECH公司），TNF-α/IL-6/IL-1β 酶聯免疫分析試劑盒（批號20150709，上海谷研實業有限公司）。

1.3 儀器

3111 型－恒溫CO2培養箱（美國Thermo 公司），ATOM 全自動酶聯免疫工作站（意大利MAROCHE），3K15-高速冷凍離心機（德國Sigma 公司），SW－CJ系列潔凈工作臺（AIRTECH，蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.4 含藥血清的制備

取清潔級雄性SD 大鼠50 只，隨機均分為空白對照組，按含生藥量分別為LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1（分別相當于臨床成人等效量的0.5，1，2 倍）等4 組，灌胃給藥，10 mL·kg-1，空白對照組給予等體積的蒸餾水，連續給藥5d，末次給藥后1 h 各組大鼠無菌條件下腹主動脈取血，3 000 × g，離心15 min 后取血清，56 ℃水浴30 min 滅活補體，同組血清混勻，0.22 μm 濾膜過濾除菌，－80 ℃保存備用。

1.5 檢測指標和方法

將對數生長期心肌細胞H9c2 以3×105個·mL-1的密度接種于6 孔板中，分成6 組，正常組、模型組、空白血清組、LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1含藥血清組?？瞻籽褰M細胞以含10% 正常組大鼠血清的培養液培養，LGZGD 含藥血清組細胞分別用含10% LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1的含藥血清的培養液培養，12 h 后除正常組之外其余各組加入20 ng·mL-1TGF-β1，培養12 h 后收集細胞上清液，3000×g離心10min，取上清液按ELISA 試劑盒說明書分別檢測TNF-α/IL-6/IL-1β 的含量。

1.6 統計學處理

使用SPSS17.0 for windows 統計軟件進行生物學分析，結果用平均數±標準差表示，多組數據間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異顯著有統計學意義。

2 結果

LGZGD 含藥血清對TGF-β1誘導H9c2 心肌細胞內TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影響，結果見表1。

ELISA 結果顯示（表1），與正常組比，20 ng·mL-1TGF-β1作用心肌細胞H9c2 12 h 后，細胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的含量明顯升高（P＜0.01），經過LGZGD 4.2，8.4 g·kg-1預處理組的H9c2 細胞TNF-α 和IL-6 的含量顯著下降（P＜0.05、P＜0.01），經過LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1預處理組的H9c2細胞IL-1β 的含量也明顯下降（P＜0.05、P＜0.01），以上結果說明LGZGD 含藥血清可以降低由TGF-β1誘導的心肌細胞H9c2 中TNF-α、IL-6 和IL-1β 等含量的升高，對心肌細胞H9c2 的損傷有一定的保護作用。

表1 LGZGD 含藥血清對TGF-β1 誘導H9c2心肌細胞內TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影響

3 討論

近年來研究發現，IL-1β、IL-6 和TNF-α 均可介導炎癥反應，并且與心衰的嚴重程度正相關[7-9]。TNF-α 是由活化的單核巨噬細胞分泌的一種細胞激動劑，可損害血管內皮，抑制心肌收縮力[10]，誘導心肌細胞凋亡或壞死，導致左心室明顯擴大，刺激成纖維細胞增殖，參與心室重構的病理過程[11-13]。IL-1β 可由多種細胞合成，主要來源于單核細胞，血管的平滑肌細胞和內皮細胞也可產生。研究證實，在CHF 中，IL-1β 可以抑制心肌蛋白質合成、促進其分解，降低心肌細胞收縮力；IL-1β 的增加還可促使其他具有負性肌力作用的細胞因子釋放增加，如：TNF-α，并與TNF-α 協同發揮負性肌力和細胞毒效應并導致心肌功能的抑制[14]。IL-6 是參與心功能異常調節的細胞因子，對心肌細胞產生細胞毒性作用，直接損傷心肌細胞，促進心肌細胞肥大和加重心室重構[15]，抑制心肌細胞的興奮收縮偶聯。與此同時，TNF-α 既可誘導合成IL-1β，又可進一步激活IL-6[16]，IL-1β 也可誘導TNF-α 的分泌，并與TNF-α 協同誘導多種細胞產生IL-6，這3 種細胞因子相互作用，共同促進心室重構及CHF 的發生發展。

研究結果表明，TGF-β1作用于心肌細胞H9c2后，IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量顯著升高，提示TGF-β1可以誘導心肌細胞H9c2 發生損傷，而經過LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1預處理組的H9c2 細胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量明顯下降（P＜0.05、P＜0.01），表明LGZGD 含藥血清對TGF-β1誘導的H9c2 細胞損傷有顯著的保護作用，其機制與抑制細胞因子過度激活有關。

[1] Jolda-Mydlowska B，Salomon P. Cytokines and remodeling of the heart in patients with congestive heart failure [J]. Pol Arch Med Wewn，2003，109（1）：23-33.

[2] Hoppeler H，Vogt M. Muscle tissue adaptations to hypoxia[J]. J Exp Biol，2001，204（18）：3133-3139.

[3] Vogt M，Puntschart A，Geiser J，et al. Molecular adaptations in human skeletal muscle to endurance training under simulated hypoxic conditions [J]. J Appl Physiol，2001，91（1）：173-182.

[4] 黃穎. 米力農對慢性心力衰竭患者心功能及血清TNF-α、IL-6 的影響[J]. 海南醫學，2013，24（24）：3657-3658.

[5] 王 靚，侯曉燕，保永亮，等. 苓桂術甘湯對急性心肌梗死心室重構模型大鼠TNF-α、IL-6 和ET-1 的影響[J]. 山西中醫學院學報，2012，13（4）：23-25.

[6] 黃金玲，王慧慧，陳慧芳，等. 正交試驗法優選苓桂術甘湯的提取工藝[J]. 安徽中醫學院學報，2011，30（6）：65-67.

[7] 周云艷，孔一慧，李為民. 心力衰竭與炎性細胞因子相關研究新進展[J]. 心血管病學進展，2014，35（5）：543-546.

[8] 梁德賢，李志文，李慶軍，等. 慢性充血性心力衰竭患者血紅蛋白、炎性細胞因子變化的臨床意義[J]. 醫藥論壇雜志，2014，35（9）：82-83.

[9] 董曉蕾，常文靜，蔡輝. 炎性細胞因子與慢性心力衰竭[J].中華老年心腦血管病雜志，2013，15（4）：438-441.

[10] 田帥，李海濱，張素華. 炎性細胞因子與心力衰竭的相關性研究[J]. 河北醫藥，2014，36（1）：44-45.

[11] Haudek SB，Taffet GE，Schneider MD，et al. TNF provokes cardiomyocyte apoptosis and cardiac remodeling through activation of multiple cell death pathways[J]. J Clin Invest，2007，117（9）：2692-2701.

[12] Frantz S，Fraccarollo D，Wagner H，et al. Sustained activation of nuclear factor kappa B and activator protein1 in chronic heart failure [J]. Cardiovasc Res，2003，57（3）：749-756.

[13] Rordorf R，Savastano S，Sanzo A，et al. Tumor necrosis factor-α predicts response to cardiac resynchronization therapy in patients with chronic heart failure[J]. Circ J，2014，78（9）：2232-2239.

[14] 段佳佳，夏大勝. 慢性心力衰竭患者炎性細胞因子的變化及作用[J]. 中國心血管雜志，2012，17（2）：93-95.

[15] 吉利，張艷. 益氣通脈飲對慢性心力衰竭大鼠心功能及血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平的影響[J]. 西部中醫藥，2015，28（5）：25-27.

[16] Irita J，Okura T，Manabe S，et al. Plasma osteopontin levels are higher in patients with primary aldosteronism than in patients with essential hypertension [J]. Am J Hypertens，2006，19（3）：293-297.