肝豆靈干預銅負荷大鼠腎損傷的代謝組學研究*

蔣懷周，王 鍵，許晶晶，董繼揚

（1.安徽中醫藥大學中醫臨床學院，安徽 合肥230031；2.廈門大學電子科學系，福建省等離子體與磁共振研究重點實驗室，福建 廈門361005）

Wilson 病（Wilson disease，WD）是一種常染色體隱性遺傳性疾病，由英國神經病學家Samuel Alexander Kinnier 在1912 年首次描述而得名。該病患者由于ATP7B 基因缺陷，導致機體合成銅藍蛋白障礙、膽汁排銅減少，銅離子沉積于各組織器官[1]。若銅沉積于腎臟，可致腎小管損傷，重吸收功能發生障礙，引起相應臨床表現。

中醫藥治療本病具有一定的優勢，其中，肝豆靈片以肝豆湯為基本方優化組合而成，是安徽省中醫院院內制劑，被應用于臨床已有40 年歷史[2-3]，臨床實踐及科研實驗證明本方對WD 具有一定的排銅和治療作用[4-5]。本實驗以代謝組學方法對肝豆靈干預的銅負荷大鼠腎組織進行研究，期望從小分子代謝角度，探討肝豆靈的腎臟排銅機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

硫酸銅（上海國藥集團）；乙醚（上海蘇懿化學試劑有限公司）；TUNEL 試劑盒（美國Roche 公司）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司）；三氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 實驗動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠，3 月齡，體質量（200±20）g，實驗動物許可證號：SCXK（皖）2011-002，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，飼養于安徽中醫藥大學省部共建教育部重點實驗室。

1.3 實驗儀器

石蠟切片機（安徽合肥電子研究所）；病理圖像分析儀（武漢清平影像技術有限責任公司）；Beckman 離心機（美國Beckman 公司）；移液器（德國Eppendorf 公司）；顯微鏡（日本Olympus 公司）；高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；冷凍干燥機（北京博醫康試驗儀器有限公司）；布魯克600MHz 核磁共振譜儀（德國布魯克公司）。

1.4 動物模型制備

造模過程中，正常組始終自由飲水攝食，模型組和肝豆靈組以銅負荷法[6]復制模型大鼠：連續12周喂飼含硫酸銅的飼料（1g/kg）和水（0.185%）。自第7 周開始，每日1 次，以肝豆靈灌胃肝豆靈組大鼠，藥物灌胃劑量為0.486g/kg；模型組和肝豆靈組以等容量生理鹽水灌胃。依據文獻[7]，若偏最小二乘判別分析（PLS-DA）得分圖中，3 組大鼠分別處于不同區域，且組內較為聚集，說明3 組大鼠代謝有差異，造模成功。造模過程中，去除不明原因死亡大鼠，剩余大鼠為正常組8 只，模型組10 只，肝豆靈組17 只。

1.5 樣本采集

造模結束后，將大鼠乙醚吸入麻醉，取新鮮腎組織，一份以液氮速凍后，置于超低溫冰箱-80℃保存，以備NMR 檢測；另一份從每組隨機取6 個樣品，以10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，待測腎小管上皮細胞凋亡情況。

2 實驗方法

2.1 細胞凋亡檢測

結合文獻[8]，參照Roche 公司TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作實驗。正常腎小管上皮細胞核呈藍色，陽性細胞（凋亡細胞）核呈棕褐色者。每張片隨機取3 個腎小管視野，計算腎小管上皮細胞凋亡指數（Apoptosis Index，AI），計算方法：AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%. 以SPSS19.0 統計軟件分析所得數據，實驗結果計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.2 腎組織提取

將所取腎組織加入由甲醇和蒸餾水配置的溶液里，低溫勻漿；加氯仿漩渦；加蒸餾水漩渦；低溫高速（4℃，10 000r/min）離心樣品；所得上清液移至離心管；真空干燥箱抽干甲醇；凍干機中將剩余液體凍干成粉末，保存于超低溫冰箱-80℃。

2.3 1H NMR 譜采集

常溫解凍粉末樣品，加入含TSP 的重水配置的磷酸鹽緩沖液震蕩；低溫離心（4℃，10 000r/min）10min，取上清液轉移至核磁管內。以Bruker 600MHz譜儀核磁采樣，實驗溫度296K。預飽和脈沖序列ZGPR（RD-90°-ACQ）采集1H NMR 譜，譜寬12kHz，弛豫延時2s，采樣點數32K，累加次數64 次。

2.4 1H NMR 譜圖處理

MestreNova 9.0 軟件打開fid 數據，傅里葉變換為NMR 譜。以TSP 譜峰為零點定標NMR 譜，相位校正和基線校正NMR 譜，以自編軟件進行譜峰對齊，截去殘余水信號和甲醇信號后，對剩余區域進行分段積分。對所得數據進行概率商歸一化（PQN）[9]，將數據導入SIMCA-P 軟件（version 14.0，Umetrics，Sweden）進行多變量分析。

3 結果

3.1 腎小管上皮細胞凋亡結果

腎小管上皮細胞凋亡檢測結果如圖1 所示：正常組腎小管上皮細胞凋亡較少，呈散在分布；與正常組相比，模型組上皮細胞凋亡指數增多（P＜0.01）；與模型組相比，肝豆靈組上皮細胞凋亡指數減少（P＜0.01），見表1。

圖1 腎小管上皮細胞凋亡（TUNEL，×400）

表1 3 組大鼠腎小管上皮細胞凋亡指數

3.2 代謝輪廓分析

大鼠腎組織典型1H NMR 譜見圖2。參照相關文獻[10-11] 和HMDB 數據庫（http：//www.hmdb.ca），將代謝物作出如下歸屬：

為了分別分析3 組代謝物之間的差異，我們對樣品預處理后的數據進行PLS-DA 分析。根據PLS-DA 得分圖里點的聚集情況可以判斷樣品類別差異，本實驗3 組樣品分別在得分圖（圖3）中處于不同區域，說明樣品間存在代謝差異。R2X、R2Y 和Q2是所建立模型的質量評價指標，交叉核實參數Q2是模型的累積預測程度，可反映預測結果的真實性，Q2>0.4 時模型的預測結果可通過[12]，而本實驗正常組-模型組-肝豆靈組、正常組-模型組、模型組-肝豆靈組的Q2分別為0.939，0.977，0.942。對本實驗樣品的PLS-DA 模型進行200次的排列實驗，如圖4 所示，正常組-模型組、模型組-肝豆靈組模型的解釋能力R2和預測能力Q2擬合線斜率大于0，提示它們在PLS-DA 模型得分圖的區分并非偶然，模型有效，驗證通過，結合本實驗細胞凋亡結果，說明造模成功[7]，藥物干預有效。

圖2 3 組大鼠腎組織的典型1H NMR 譜

圖3 腎組織樣品的PLS-DA 得分圖

圖4 腎組織樣品的PLS-DA 模型驗證圖

根據代謝物譜峰在PLS-DA 模型的VIP 值、回歸系數值以及t 檢驗結果，我們發現了一些對3 組組間差異貢獻較大的代謝物，并將這些差異代謝物列入表2。

4 討論

腎臟是機體代謝最重要的器官之一，通過尿液的生成和排泄，它可以排出人體大部分的代謝最終產物，調節人體水、電解質和酸堿平衡，維持機體內環境相對穩定。WD 患者腎組織銅含量約比正常人高10 倍左右，由于腎小管上皮細胞的特殊結構和功能，銅主要沉積在WD 患者腎臟近端小管、遠端小管，腎小球囊亦有銅粒沉著。光鏡下可見患者近端腎小管上皮細胞扁平化、基底膜增厚、刷狀緣消失，部分遠端小管上皮輕度脂肪變性，腎小球毛細血管管腔狹窄或者閉塞。隨著病情加重，患者可出現腎小管重吸收功能障礙，臨床表現為腎性糖尿、蛋白尿和氨基酸尿等，少數患者可發生腎小管性酸中毒、腎病綜合征等[13]。本實驗模型組大鼠腎組織細胞凋亡指數增高，肝豆靈組大鼠腎組織細胞凋亡指數降低，說明銅負荷造模對大鼠腎臟造成了一定的損傷，而肝豆靈可有效抑制銅負荷所導致的腎損傷。

表2 大鼠腎組織特征代謝物

肝豆靈主要由大黃、黃連、黃芩、半枝蓮、穿心蓮、萆薢、澤瀉、金錢草等組成。其中，大黃清熱通腑，蕩滌熱結，黃連、黃芩、半枝蓮、穿心蓮苦寒清熱，瀉火解毒，萆薢、澤瀉、金錢草瀉熱通淋、利濕祛濁。以上諸藥合用，可起到清熱解毒，通腑利尿的作用，不僅能夠促進尿銅的排泄，還可以促進銅從其正常渠道膽汁排出。以肝豆靈治療WD 腎損傷患者，發現本方可降低患者的尿微量蛋白含量，提示肝豆靈對WD 腎損傷具有一定的干預作用[14]。本方的君藥是大黃，現代醫學發現，以大黃水煎劑干預慢性腎功能衰竭大鼠，可降低模型大鼠血清肌酐和尿素氮水平，改善腎性貧血癥狀，糾正鈣、磷、鎂等電解質代謝紊亂和酸中毒，改善蛋白質代謝紊亂，對腎小管損傷有一定的保護作用[15]。在同樣是金屬中毒所致的腎損傷研究中發現，大黃的有效成分大黃酸可降低鎘中毒所引起的氧化應激反應，減輕亞慢性鎘中毒小鼠的腎損傷[16]。本方其他成分如半枝蓮具有抗氧化活性，能夠減輕小鼠腎臟氧化應激所致細胞凋亡[17]，黃連[18]、黃芩[19]、萆薢[20]、金錢草[21]、澤瀉[22]對多種腎臟損傷具有不同角度的干預作用。

本實驗以肝豆靈干預銅負荷模型大鼠，結果顯示模型大鼠苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、肌苷、天冬氨酸含量降低，給予肝豆靈干預后，這些小分子含量有所恢復。

苯丙氨酸和酪氨酸屬于芳香族氨基酸，苯丙氨酸羥化酶可催化苯丙氨酸生成酪氨酸。腎臟與芳香族氨基酸的合成、分解和排泄密切相關，是體內芳香族氨基酸代謝的主要器官之一[23]，也是苯丙氨酸轉化為酪氨酸的一個重要場所[24]。文獻報道通過測芳香族氨基酸含量，可以幫助探知腎損傷情況[25-26]。在代謝組學研究中亦發現，腎損傷時芳香族氨基酸含量具有一定的改變[16，27]，本實驗模型組大鼠腎組織苯丙氨酸和酪氨酸含量發生了變化，與以上研究結果相符。經肝豆靈干預后，大鼠這兩種氨基酸含量有所恢復，說明肝豆靈對銅負荷腎損傷的干預可能涉及芳香族氨基酸的代謝。

亮氨酸和纈氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸，它們作為氮的載體，在維持機體氮平衡和蛋白質代謝中發揮著重要的作用。臨床上對于腎損傷的患者，可補充支鏈氨基酸，增加體內蛋白合成，降低血尿素氮水平，有助于恢復病人的體能，是腎損傷病人重要的支持治療手段[28-29]。以基因組學和蛋白質組學研究納米銅對腎臟的影響，發現銅染毒大鼠腎損傷涉及支鏈氨基酸的異常降解[30]。對模型小鼠狼瘡性腎炎研究發現，中成藥昆仙膠囊可升高模型小鼠異常降低的支鏈氨基酸水平，可能是該藥的治療作用途徑之一[31]。以上研究結果提示，腎損傷可能與支鏈氨基酸代謝具有一定的聯系。本實驗模型組亮氨酸和纈氨酸含量降低，經肝豆靈干預后其含量回升，提示肝豆靈可能通過調節支鏈氨基酸的代謝，幫助維持機體氮的平衡，干預銅過量對腎臟的損傷。

谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸是參與氨代謝的重要氨基酸，氨在腎臟的代謝主要由腎小管上皮細胞完成。肝豆靈干預后，大鼠腎組織谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸含量向正常范圍恢復，且腎小管上皮細胞凋亡指數較模型組有所降低，可能提示肝豆靈對氨的代謝具有調節作用，或許與抑制腎小管上皮細胞凋亡具有一定聯系。

本實驗中，我們以核磁共振代謝組學方法分析肝豆靈干預銅負荷大鼠后，大鼠腎組織小分子代謝物的變化，發現肝豆靈對銅負荷大鼠腎損傷具有一定的干預作用，其機制可能涉及對芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）、支鏈氨基酸（亮氨酸、纈氨酸）的調節；抑制腎小管上皮細胞凋亡、調節腎臟氨的代謝。本結果可為臨床對WD 患者的腎損傷治療提供一定的機制參考。

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