清熱解毒化濁片對腸源性內毒素血癥大鼠肝肺促炎因子IL-8及抗炎因子IL-10 的影響*

毛婭男，趙國榮，連俊凱，陳研焰，李雄安，何宜榮，艾碧琛

（湖南中醫藥大學中醫學院，湖南 長沙410208）

正常情況下，機體腸道內存在由大量G-細菌釋放的內毒素（LPS），由于腸道粘膜的屏障作用，肝巨噬細胞（KC）的清除作用，LPS 很難進入體循環，當腸粘膜完整性破壞，KC 吞噬能力障礙時，大量LPS 入血，形成內毒素血癥，引發全身炎癥反應，因LPS 來自于腸道，故稱為腸源性內毒素血癥（IETM）。IETM 形成后可激活KC 大量釋放炎性因子，造成肝、肺炎性損傷[1]，IETM 是急性肝衰竭、急性肺損傷、肝肺綜合征、全身炎癥反應綜合征發生的重要原因。臨床對于IETM 的治療重點在于改善并發癥，控制病情，尚無針對IETM 療效確切的藥物。清熱解毒化濁片為湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，具有減輕炎癥反應，保肝護肝作用[2]。前期研究表明清熱解毒化濁片可降低血漿內毒素水平，終止肝損傷的惡性循環，達到減輕肝臟炎性反應的目的[3]。本研究擬建立IETM 肝肺損傷大鼠模型，進一步探討清熱解毒化濁片對肝肺的保護作用。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD 大鼠70 只，體質量為（200±10）g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。許可證號：SYXK（湘）2013-0005，合格證號：43004700007002。

1.2 藥物與飼料

清熱解毒化濁片由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供（批號：20140605），52°紅星二鍋頭由北京紅星股份有限公司提供（批號：20140128），大鼠普通飼料及高脂高糖飼料由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供。高脂高糖飼料綜合文獻[4]配制方法上進行改進，其組成為：77.3%基礎飼料+0.2%丙基硫氧嘧啶+2%膽固醇+10%豬油+0.5%膽鹽+8%蛋黃粉+2%白糖。

1.3 試劑與儀器

鱟試劑盒由湖南中醫藥大學第一附屬醫院肝病檢測室提供，生化檢測試劑盒由湖南中醫藥大學生化檢測中心提供，IL-8、IL-10 兔抗鼠抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供，通用型PV-9000試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。羅氏全自動生化分析儀（羅氏公司生產），RT-6000 酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司），Motic B5顯微成像系統（麥克奧迪實業集團公司），電熱恒溫箱（上海精宏實驗設備有限公司），電熱恒溫干燥烤箱（北京中興偉業儀器有限公司），石蠟切片機、攤片機（天津市久圣醫療電子儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備

綜合文獻[5-6]方法并加以改進，予高脂高糖飼料喂養大鼠，同時每天按10mL/kg 劑量予52°二鍋頭灌胃1 次，并每周稱大鼠體質量，根據體質量調整白酒劑量。以血液生化指標及肝、肺組織病理切片判斷造模成功與否。

2.2 分組及給藥

取SD 大鼠70 只，隨機分為空白組（10 只）和造模組（60 只）。造模組大鼠按2.1 方法進行造模。模型成功后，將造模組大鼠隨機分為模型組（10只）、清熱解毒化濁片組（10 只），清熱解毒化濁片組按0.081g/mL 灌胃，模型組及正常組予等容積蒸餾水灌胃，每組動物灌胃量均為1mL/100g·d-1，連續給藥4 周。

2.3 取材及指標檢測

末次給藥結束后，禁食不禁水12h，次日清晨，腹主動脈采血，3 000r/min，離心10min，取血清，采用羅氏分析儀分別檢測血清ALT、AST、GGT、ALP的含量，動態濁度法檢測血漿LPS 含量。同時，迅速摘取肝、肺臟，在肝、肺臟最大葉，距邊緣5mm 處取小塊肝、肺組織，部分用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察肝、肺組織病理學改變，部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，利用免疫組化PV 二步法檢測肝、肺組織中IL-8、IL-10 含量，采用光學顯微鏡和全自動圖像獲取系統Olympus DP71 在高倍鏡視野（×400）下隨機選取5 個區域，測量并記錄每個視野陽性染色的平均灰度值，作為該片的代表值，再計算該組的平均灰度，進行統計學比較。

2.4 統計學分析

采用SPSS17.0 統計軟件處理。計量資料數據按均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠肝、肺組織病理學改變

正常組大鼠肝小葉輪廓清晰，肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列。模型組可見肝小葉結構破壞，呈點、片狀壞死，肝細胞水腫明顯，胞質中可見大小不等、數量不一的圓形脂肪空泡，小葉中央靜脈周圍和匯管區有炎性細胞浸潤。清熱解毒化濁片組肝細胞輕微腫脹，結構較疏松，部分肝細胞內線粒體疏松，結構欠清晰。結果見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學形態觀察（HE 染色×400）

正常組大鼠肺泡隔間距小，肺泡形態完整未見明顯炎細胞浸潤。模型組肺泡隔間距明顯增寬，肺泡形態擠壓，明顯炎細胞浸潤，有間質水腫可能。清熱解毒化濁片組肺泡隔間距較正常組的增寬，肺泡形態完整可見少量炎細胞浸潤。結果見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理學形態觀察（HE 染色×400）

3.2 清熱解毒化濁片對大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP，血漿LPS 的影響

與正常組比較，模型組具有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05），提示造模成功。經治療后，與模型組比較，清熱解毒化濁片組血清ALT、AST、GGT、ALP均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。結果見下頁表1。

3.3 清熱解毒化濁片對大鼠肝、肺組織IL-8、IL-10的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝、肺組織IL-8 表達存在顯著性差異（P＜0.01）。經治療后，與模型組比較，清熱解毒化濁片組肝、肺組織IL-8 表達明顯降低（P＜0.01），IL-10 表達升高（P＜0.05）。結果見下頁表2、圖3-4、圖5-6。

表1 各組大鼠ALT、AST、GGT、ALP、LPS 的比較（x±s，n=10）

表2 各組大鼠肝、肺組織IL-8、IL-10 表達的比較（x±s，n=10）

圖3 各組大鼠肝組織IL-8 陽性表達觀察（免疫組化×400）

圖4 各組大鼠肺組織IL-8 陽性表達觀察（免疫組化×400）

4 討論

中醫尚無相應病名的論述與記載，據研究G-細菌所引起的疾病類似濕熱病證的特點，而濕熱病患者血漿內毒水平升高[7]，可見IETM 的中醫病因病機與濕熱濁毒有關。過食肥甘、嗜酒貪杯，致脾失健運，濕濁內生，濕久釀熱，熱久蘊毒，濕熱濁毒膠著，熱蒸濕動，彌漫臟腑經絡，出現各臟腑的濕熱癥狀。因此，中醫治療IETM 重點在于清熱解毒，祛濕化濁。清熱解毒化濁片由茵陳、滑石、木通、豆蔻仁、藿香、澤瀉、黃芩、薄荷、連翹等組成，其中茵陳、木通、澤瀉、滑石利濕化濁，導濕熱從小便而出；藿香、豆蔻芳香化濕，導濕從表而解；黃芩、連翹、薄荷清熱解毒，透熱外達。全方分消上下，透達內外，共奏清熱解毒、利濕化濁之效。臨床發現，清熱解毒化濁片對于濕熱內蘊證患者有良好的治療作用[8]。本實驗通過高脂高糖、酒精等復合因素建立IETM 肝、肺損傷大鼠模型，經清熱解毒化濁片治療后，肝、肺損傷減輕，提示IETM 的形成與中醫濕熱濁毒密切相關。

圖5 各組大鼠肝組織IL-10 陽性表達觀察（免疫組化×400）

圖6 各組大鼠肺組織IL-10 陽性表達觀察（免疫組化×400）

多項研究認為IETM 是肝、肺損傷，肝肺綜合征形成的病理基礎。IETM 引發肝臟“二次打擊”，從而激活KC 釋放炎性介質如TNF-α、IL-1、IL-8 等，一方面炎性因子隨血流入肺臟，導致肺臟炎性損傷；另一方面由于肝的解毒能力下降，被激活的肺內巨噬細胞代償性清除LPS，同時分泌大量活性物質如NO、CO、TNF-α、IL-1、IL-8 及其他的炎性介質，加重肺臟損傷[9-10]。據文獻報道，降低LPS 水平，可直接拮抗IETM 效應，達到減輕肝、肺炎性損傷的目的[11]，而前期研究發現清熱解毒化濁片有降低患者血漿內毒素水平的作用。本研究通過復合因素建立IETM致肝、肺損傷大鼠模型，血漿LPS 水平升高（P＜0.05），血清ALT、AST、GGT、ALP 明顯升高（P＜0.01，P＜0.05），肝、肺組織出現炎性浸潤、結構破壞等病理學改變，提示造模成功。經清熱解毒化濁片治療后血漿LPS 明顯降低（P＜0.01），血清ALT、AST、GGT、ALP 均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），肝、肺組織炎性細胞浸潤減輕，結構較前清晰，與文獻報道一致，提示清熱解毒化濁片可減輕因IETM 所致的肝、肺炎性損傷，其作用機制與降低血中LPS 水平有關。

IL-8 是一種促炎癥因子，能特異性地促進中性粒細胞的趨化、變形、脫顆粒、釋放溶酶體酶等參與炎癥反應，與多種炎性疾病的發生發展密切相關[12]。當IETM 形成后LPS 即與KC 中TLR-4 受體結合導致TLR-4 寡聚化而被激活，通過MyD88 依賴和非MyD88 依賴的兩條途徑觸發一系列的信號級聯反應，誘導NF-KB、AP-1 和IRF-3 等轉錄因子磷酸化和核轉位，上調IL-8 的表達，大量IL-8 釋放入血，參與全身炎癥反應[13]。研究認為，降低IL-8 的表達可減輕肝、肺組織的炎性損傷[14-15]。本實驗，IETM致肝、肺損傷大鼠模型中，肝、肺組織炎性浸潤，IL-8 表達水平明顯升高（P＜0.01），經清熱解毒化濁片治療后肝、肺組織IL-8 明顯降低（P＜0.01），炎性損傷減輕，與文獻報道一致，提示清熱解毒化濁片具有降低IL-8 水平，從而改善組織炎性損傷的作用。IL-10 是重要的抗炎因子，既能下調T 淋巴細胞活性，抑制炎性細胞的激活、遷移和粘附，又可通過介導IKK-b/NF-κB 通路在轉錄水平上抑制炎性因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等表達，改善炎癥反應[16]。本實驗清熱解毒化濁片組大鼠肝、肺組織均出現IL-10 表達較其他組明顯升高（P＜0.01），提示清熱解毒化濁片可升高IL-10 的水平，達到抗炎作用。

綜上所述，清熱解毒化濁片具有清熱解毒、利濕化濁的功效，可治療因IETM 所致的濁毒蘊結，其作用機制與降低血漿LPS 水平，促進抑炎因子IL-10 的表達，降低促炎因子IL-8 的釋放，減輕肝、肺組織炎性損傷有關。

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