人參皂苷Rg1通過糖皮質激素受體相關NF-κB信號通路發揮抗炎作用抵抗酒精性肝炎研究

高 巖，楚世峰，陳乃宏,3*（.中國醫學科學院北京協和醫學院神經科學中心藥物研究所，北京 00050；.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 40007；3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 4008）

·補益藥研究·

人參皂苷Rg1通過糖皮質激素受體相關NF-κB信號通路發揮抗炎作用抵抗酒精性肝炎研究

高 巖1，楚世峰2，陳乃宏1,3*
（1.中國醫學科學院北京協和醫學院神經科學中心藥物研究所，北京 100050；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的人參皂苷Rg1是人參提取物中最具藥理活性的皂苷之一。基于實驗室前期研究及對肝炎的認識，本實驗的目的在于研究Rg1在酒精誘導的小鼠肝炎模型中是否發揮抗炎作用，并探討其可能機制。方法口服給予C57BL/6小鼠6 g/kg酒精，1 h后給予Rg1（10，20或40 mg/kg）或者陽性對照地塞米松（1 mg/kg）連續9 d。對血清進行生化分析、肝組織染色觀察、免疫組化以及WB蛋白檢測。結果與模型組比較，發現Rg1顯著提高小鼠的生存率并降低異常升高的血清生化指標 （P＜0.05）。病理和超顯微結構表明酒精性肝損傷后肝組織病變情況，而Rg1反轉其病變。過度產生的炎癥因子包括TNF-α、IL-1β及IL-6亦被Rg1抑制。Rg1通過影響糖皮質激素受體調節NF-κB使肝臟恢復到正常情況。結論Rg1可能發揮配體作用促進糖皮質激素受體調節NF-κB進而對抗酒精性肝炎。

人參皂苷Rg1;酒精性肝炎;抗炎作用;糖皮質激素受體;NF-κB

酒精性肝炎(Alcoholic liver disease,ALD)在世界范圍內均是一種高發病率和死亡率的疾病誘因[1]，而酒精性肝炎的誘因包括肝性脂質變性，進程性的肝纖維化，肝硬化到肝細胞癌[2]。每年全球濫用酒精引發約330萬人死亡，大約5.1%的全球負擔來自酒精濫用[3]。酒精性肝炎的進程與多因素相關，包括基因遺傳、營養以及環境因素等。

肝臟是主要的代謝器官，有毒化學物質乃至藥物都可以誘發肝損傷[4]。酒精誘發的肝臟損傷主要包括直接對肝細胞的損害及代謝產物毒性，氧化應激則是其中的主要原因，誘發炎癥級聯反應。甾類激素能阻止肝臟炎癥反應。在嚴重肝炎情況下，激素可以提高短期生存率[5]。糖皮質激素是抗炎常用藥，可以抵抗炎癥，免疫反應和活化轉錄因子等[6]。糖皮質激素可以與其受體結合，激活后可以入核，激活或者抑制下游相關的基因表達。糖皮質激素主要通過調節NF-κB來發揮抗炎作用[7]。激素具有有效的抗炎作用，但是長期使用可能會誘發嚴重副反應，甚至導致炎癥積聚。大量和長期使用糖皮質激素會導致水鹽平衡失調。激素對一些嚴重肝炎患者甚至無效[5]。

人參是一種運用廣泛的藥用植物，可以發揮很好的生化和藥理學作用[8]。人參皂苷Rg1是一種活性較強的皂苷，具有很好的補益作用提高中樞神經系統的學習能力和記憶力[9]。除了在神經藥理學方面的應用外，Rg1在肝病保護中也發揮了獨特的作用：包括脂多糖/氨基半乳糖，四氯化碳及缺血等實驗模型[10-14]。在此次實驗中我們發現Rg1抑制了NF-κB的作用，而這種作用與糖皮質激素有著密切的關系，特別是Rg1通過糖皮質激素受體發揮抗炎作用時并未產生相應的副作用。所有結果證明Rg1可以作為潛在的臨床用藥對抗酒精性肝炎。

1 材料

1.1 藥品及試劑

Rg1購自云南極粹生物科技有限公司；酒精購自紅星酒廠；陽性對照藥地塞米松購自Adamas-beta公司；米非司酮（RU486）購自紫竹藥業；抗體購自Santa Cruz或Sigma公司；其他試劑為國產或進口分析純試劑。

1.2 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠購自維通利華有限公司，SPF級，體質量18-22 g。常規飼養，實驗過程遵守實驗動物與保護的有關規則。

2 方法

2.1 實驗分組

小鼠隨機分為7組，提前給予RU486，Rg1或地塞米松3 d。組別：空白對照組，模型組(6 g/kg)，RU486組(20 mg/kg)，地塞米松陽性對照組(1 mg/ kg)，Rg1組(40 mg/kg)，地塞米松&模型組，Rg1&模型組。

2.2 模型制備

小鼠適應性伺養7 d，飲食飲水自理。實驗開始時，首先給予Rg1,RU486地塞米松3 d，劑呈同上。之后給予除空白對照組以外各組灌胃酒精 （6 g/ kg），1 h前灌胃給予Rg1（10，20或40 mg/kg）地塞陽性對照組地塞米松（1 mg/kg）連續9 d實驗期間觀察小鼠體質量變化及毛色等改變，記錄小鼠死亡率變化。取材前1 d晚禁食，留取肝組織及血清，進一步實驗分析。

2.3 指標檢測

2.3.1 線粒體電鏡檢測 取小鼠肝臟組織戊二醛固定，電鏡下觀察小鼠肝臟線粒體受損情況（北京天壇醫院）。

2.3.2 細胞因子測定 通過合成炎癥因子相關引物，利用RT-PCR方法觀察Rg1對抗炎癥因子作用。

2.3.3 肝臟病理學檢查 取小鼠肝臟組織，4%甲醛固定，常規病理切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.4 統計學方法

實驗結果依據數據處理軟件Graphpad 5.0進行統計分析，數據用組間差異顯著性表示。

3 結果

3.1 Rg1提高肝炎小鼠生存率

如圖1所示，模型組小鼠生存率在第2天由90%降至第9天的10%(P＜0.001)；Rg1各組 (10,20 和 40 mg/kg)生存率分別為 50%，50%和 70% (40 mg/kg,P＜0.05)。空白對照組小鼠在整個實驗周期無死亡發生。

3.2 Rg1保護線粒體超微結構

依據電鏡結果可以發現模型組與空白對照組相比具有很大差異。在對照組中(圖2)，肝細胞微結構正常；模型組中出現空泡，線粒體嵴結構破壞甚至消失。在給予Rg1之后，超微結構部分恢復接近空白對照組。

3.3 Rg1逆轉過度生成的炎癥因子

炎癥因子IL-6與酒精性肝損傷息息相關。酒精不僅可以活化巨噬細胞，也可以強烈促進炎癥因子的釋放。如圖3所示，與空白對照組相比，IL-6在模型組中顯著增加，但是Rg1可以緩解這一變化。與IL-6類似，炎癥相關的TNF-alpha和IL-1beta在RNA水平也有顯著的降低。但是給予RU486后，Rg1的這一緩解作用受到抑制。

圖1 人參皂苷Rg1提高酒精損傷小鼠生存率（n=4）

圖2 人參皂苷Rg1改善小鼠肝臟超微結構異常變化

圖3 Rg1影響TNF-alpha、IL-1beta和IL-6炎癥因子的表達（n=4）

3.4 糖皮質激素配體Rg1緩解肝病變

通過HE染色觀察可以發現，與正常對照組相比，酒精模型組有炎癥細胞浸潤；Rg1&RU486組可見靜脈擴張，內膜脫落，肝細胞腫脹、壞死，匯管區有大量炎癥細胞浸潤。與超顯微結果類似，給予Rg1后可以明顯改善嚴重的肝細胞壞死情況，而RU486可以抑制Rg1該種保護作用。如圖4所示。

3.5 Rg1調節糖皮質激素受體及其相關NF-κB信號通路

RU486是一種糖皮質激素受體抑制劑，阻斷糖皮質激素受體入核發揮作用。根據WB結果可知，在病理情況下，Rg1與地塞米松均表現出促進糖皮質激素入核作用。而這種作用被RU486阻斷，這表明Rg1可能與地塞米松類似是一種糖皮質激素配體。同時我們發現，酒精促進NF-κB入核，而NF-κB作用被Rg1阻斷，p-IκB生成減少。同樣Rg1抑制NF-κB入核的作用被RU486阻斷。如圖5所示。

以上結果提示，Rg1可能通過促進糖皮質激素受體及其相關NF-κB信號通路發揮抗肝炎作用。Rg1可能是一種糖皮質激素受體的配體。

圖4 人參皂苷Rg1對組織形態學影響（H&E染色）

4 討論

作為一種在全世界十分常見的流行公共健康問題，酒精性肝損傷導致嚴重的公眾負擔和健康危害[15-17]。在中國酒精性肝損傷被認為是排在病毒性肝炎之后的第二大疾病[18]。酒精誘發的損傷主要發生在肝臟，因為肝細胞具有多種調節代謝相關的酶系統，包括乙醇脫氫酶，乙醛脫氫酶以及CYP2E1等。過度的酒精代謝能損傷糖皮質激素受體功能，導致持續的炎癥反應。目前營養療法是比較有效治療酒精性肝炎的療法。而激素治療雖然已經被使用多年，但是因為其有嚴重的副作用仍然被限制使用。所以尋找到一種臨床使用安全有效的藥物十分必要。

給予Rg1可以有效提高C57BL/6小鼠生存率，逆轉血清生化指標異常升高。同時，組織學病變也被Rg1逆轉，抑制炎癥因子的過度產生。Rg1可能作為糖皮質激素受體的配體，促進糖皮質激素受體入核發揮抗炎作用，阻止NF-κB活化入核阻止其下游相關產物表達。加入RU486后，Rg1及地塞米松調節糖皮質激素受體阻斷NF-κB的作用消失，表明Rg1可能是糖皮質激素受體的配體。Rg1不僅在中樞神經系統中具有很好的藥理學作用，在對抗肝臟疾病時也有顯著療效。盡管我們發現了Rg1作為潛在抗酒精性肝炎的藥物，但是需要更多的實驗研究Rg1的藥理機制及潛在風險。

圖5 病理情況下給予人參皂苷Rg1對肝臟GR及NF-κB的作用（n=4）

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（本文編輯 李 杰）

Anti-inflammatory Function of Ginsenoside Rg1 on Alcoholic Hepatitis through Glucocorticoid Receptor Related Nuclear Factor-kappa B Pathway

GAO Yan1,CHU Shifeng2,CHEN Naihong1,3*
(1.State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines,Department of Pharmacology,Institute of Materia Medica,Neuroscience Center,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050,China;2.Key Laboratory of Diagnostics of Traditional Chinese Medicine,Collaborative Innovation Center of Digital Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 3.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveGinsenoside Rg1 is one of the most pharmacological active constituents from ginseng extract.Based on prior experimental results and the understanding of alcoholic hepatitis,the major aim of this study is to investigate whether Rg1 is beneficial in a rodent model mimic alcoholic hepatic injury associated with binge drinking and explore the underlying possible mechanisms.MethodsC57BL/6 mice were given oral consumption of 6 g/kg alcohol 1 h after treated with Rg1(10, 20 and 40 mg/kg)or dexamethasone (1 mg/kg)for 9 consecutive days.Blood were performed biochemical analyses and liver fragments were processed for microscopy, immunohistochemistry and western blot analysis.ResultsCompared with the model group,Rg1 treatment significantly reversed the high mortality rate induced by alcohol consumption and also alleviated liver impairment as evidenced by the decrease of serum parameters.Meanwhile,histological and ultrastructural analysis of alcoholic groups showed hepatocellular impairment but restored in Rg1-treated groups.Overproductive inflammatory cytokines including TNF-α,IL-1β and IL-6 were also suppressed by Rg1.Rg1 modulated liver to normal levels by adjusting the glucocorticoid receptor related NF-κB pathwayConclusionThis study demonstrates that Rg1 might promote glucocorticoid receptor mediating the repression of NF-κB and inhibit the inflammatory reactions in alcoholic hepatitis.

ginsenoside Rg1;alcoholic hepatitis;anti-inflammation;glucocorticoid receptor;NF-κB pathway

R285

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.12.001

2015-11-25

國家自然科學基金項目（81274122、81373997、81273629、81473570）；國家“重大新藥創制”科技重大專項（2012ZX09301002-004、2012ZX09103101-006）；教育部長江學者和創新團隊發展計劃（PCSIRT）（IRT1007）；教育部博士點基金重點項目（20121106130001）；北京市自然科學基金（7131013、7142115）；新藥作用機制研究與藥效評價北京市重點實驗室資助項目（BZ0150）。

高 巖，女，在讀博士研究生，研究方向：中藥防治肝病研究。

*陳乃宏，男，教授，博士研究生導師，E-mail：chennh@imm.ac.cn。